| 研究課題/領域番号 |
16K07321
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
山元 淳平 大阪大学, 基礎工学研究科, 助教 (90571084)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | DNA修復 / DNA損傷 / 光回復酵素 / クリプトクロム |
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| 研究実績の概要 |
申請者が提唱した野生型(6-4)光回復酵素によるDNA修復の２光子反応機構において、励起状態のFADH-から損傷DNAへの電子移動後に生成するセミキノン型FADHラジカルの寿命について、１光子目の反応と２光子目の反応において差異があると予想し、時間分解過渡吸収測定を行った。その結果、１光子目の反応では数十マイクロ秒の寿命を有するのに対し、２光子目の反応では数百ナノ秒の寿命であることがわかった。このことから、１光子目と２光子目の各々の反応において、異なる化学種が反応に関与している可能性が示唆され、申請者の予想が正しいことが裏付けられた。
また、ミツバチ由来のクリプトクロムに関して、大阪大学構内で捕獲したミツバチからmRNAの抽出を行い、クリプトクロムのcDNAの配列解析を行ったところ、マウス由来のクリプトクロムと非常に高い相同性を示すことが明らかとなった。さらに、(6-4)光回復酵素との相同性も高く、(6-4)光回復酵素活性中心のアミノ酸側鎖はほぼ完全に保存されていたため、クローニングしたクリプトクロムによる生体内DNA修復実験を行ったところ、(6-4)光回復酵素との高いアミノ酸相同性を有するにもかかわらず、DNA修復能が欠失していることが確認できた。
ヒト由来のクリプトクロムについても、HeLa細胞からmRNAを抽出し、同様にクローニングを行った。まずは、光回復酵素と相同性の高いドメインについてのみクローニングし、大腸菌を用いたタンパク質調製を試みたが、封入体に取り込まれてしまい、うまくいかなかった。そこで、昆虫細胞でのタンパク質調製用プラスミドの調製を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
(6-4)光回復酵素およびクリプトクロムにおいて、概ね初年度に行う予定の実験を行うことができた。クリプトクロムについては、当初の計画よりも順調に進行しており、クローニングからその性質解析まで実施できた一方で、(6-4)光回復酵素については最も重要な実験結果を得ることはできたものの、野生型酵素を用いた実験にとどまっており、変異体を用いた実験までは行えていない。しかし、得られた結果は予想通りであり、非常に重要な知見の獲得に成功したため、全体として順調に進行していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
(6-4)光回復酵素の変異体を用いた実験において、予想よりも濃いタンパク質が必要であったため、まずは変異体タンパク質の大量調製から実施する必要がある。これを用いて、電子移動後に生成するセミキノン型FADHラジカルの寿命を同様に測定する。
また、ミツバチ由来クリプトクロムについては、タンパク質調製に移行する。まずは大腸菌を用いたタンパク質調製を行うが、これがうまくいかない場合、昆虫細胞を用いたタンパク質調製に速やかに移行する。
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