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2017 年度 実施状況報告書

ヒト癌抑制遺伝子候補101F6によるレドックス擾乱細胞死誘導機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 16K07323
研究機関神戸大学

研究代表者

鍔木 基成  神戸大学, 理学研究科, 教授 (00145046)

研究分担者 木村 哲就  神戸大学, 理学研究科, 特命講師 (70506906)
武内 総子  神戸大学, 理学(系)研究科(研究院), 研究員 (00448169)
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード膜タンパク質 / 電子伝達 / ヘム / アポトーシス / ナノディスク / シトクロムb561 / アスコルビン酸 / 生体膜
研究実績の概要

ヒト染色体3p21.3領域に存在する101F6遺伝子は顕著な癌抑制作用を示す事が知られているが、その分子機構については不明である。101F6遺伝子産物は2個のヘムbを含有する膜貫通型タンパク質で b561ファミリーの一員であることから、アスコルビン酸(AsA)あるいはモノデヒドロアスコルビン酸(MDA)ラジカルが関与する生体膜貫通レドックス反応がその生理機能発現に深く関与していると思われる。本研究ではAsA/MDAラジカルによる生体膜内外でのレドックス擾乱をプログラム細胞死へと導く細胞内メッセージとして捉え、その細胞死シグナルを生体膜(ER膜)において発生・制御する素子としての101F6タンパク質の役割と分子機構を解明することを目的としている。
我々はメタノール資化性酵母Pichia pastorisによる101F6タンパク質発現系を用い、大量発現と高純度精製方法を確立した。並行して、ヒト癌組織由来のA549細胞を培養し、界面活性剤DDMあるいはβ-OGにより細胞抽出液を調製・回収した。細胞抽出液と精製101F6タンパク質を充分に混和した後、101F6タンパク質を特異的に認識・結合する抗体を用いた磁気beads抗体法により、101F6タンパク質と相互作用すると思われるいくつかのタンパク質をSDS-PAGEと銀染色法で解析した。この解析方法によって再現性のある結果を得るためには、101F6タンパク質と界面活性剤とのミセル状態のままでは、たとえ精製したタンパク質を使用しても必ずしも生体膜中でのタンパク質間相互作用を反映していない可能性がある。そこで生体膜の非常に良いモデルであるナノディスク環境中に101F6タンパク質を再構成させた状態で免疫沈降・解析する計画を進めている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

101F6タンパク質も他のb561ファミリーメンバーと同様に生体膜(おそらくはER膜)貫通構造を保持していることから、膜貫通電子伝達反応を利用した分子生理機能を持つと推定される。このことが癌抑制遺伝子としての生理機能発現に必須であるならば、101F6はこれまでの癌抑制遺伝子のものとは非常に異なる機構に基づいて機能していることになる。神経型あるいは植物型b561の場合、AsAとの結合部位を構成する細胞質側ヘムのHis配位子近傍には保存性Tyr残基やLys残基が存在するが、101F6の場合、それらはPheとAla残基に置換されている。これら残基をそれぞれTyrとLysに戻してやると、神経型あるは植物型b561に特徴的な生化学的性質(電子伝達のpH依存性、DEPCとの反応性の復活とそれによるAsAからの電子伝達阻害)を示すようになる。この結果はAsA/MDAラジカルのと反応性がヘム周辺・基質結合部位の微細な分子構造の変化により制御可能であることを示してる。現在、ヒト由来培養細胞中における101F6遺伝子の機能についての細胞生物学的解析、特に101F6タンパク質との相互作用に重点をおいたプロテオーム解析を行っている。これらの解析には再現性の問題など、いろいろ困難を伴う。具体的には101F6タンパク質を界面活性剤で可溶化したミセル状態のままでは、いくら高純度に精製した状態であっても、本来の生体膜中でのタンパク質間相互作用を反映していない可能性がある。そこで、生体膜の非常に良いモデル系であると考えられるナノディスク環境中に101F6タンパク質を再構成させた状態で免疫沈降をする計画を進めている。既にナノディスク作成に必要な2種類のMSPタンパク質の発現・精製を終え、101F6タンパク質との再構成とFPLCによるゲルろ過クロマトグラフィーによる精製にも成功している。

今後の研究の推進方策

101F6はb561ファミリー中のTSF型に属するが、非常に特異な性質を持っている。①TSF型サブファミリー中でのアミノ酸配列の保存性が下等動物から高等動物に渡って非常に高いこと、②神経系型や植物型b561にはAsA/MDAラジカルとの結合及び電子伝達に関与すると思われる保存配列が存在するが、TSF型ではこれらの配列は保存されておらず、替わって別の非常に良く保存された配列が存在する。これは101F6がAsA/MDAラジカル以外の酸化還元基質との間で電子伝達反応を行っているか、あるいはAsA/MDAラジカルと電子伝達反応を行う場合であっても、その分子機構が非常に異なっている事を示唆している。b561ファミリー内で独自の進化を遂げた101F6は膜貫通レドックスセンサーとして機能することにより細胞内外でのシグナル伝達機構に深く関わっている可能性が高い。既に野生型101F6タンパク質はb561ファミリーメンバーとしての基本的性質を保持していること(2個のヘムを含有し、AsAからの早い電子受容反応を行いうること)を明らかにしているが、③MDAラジカルへの電子供与が非常に速い、④電子伝達反応のpH依存性が他のb561とは異なる、等が異なっている。これらの特異な性質の原因として、上に挙げた特異な保存配列の寄与が考えられる。よって保存性部位に対する部位特異的変異体を作成し、その影響を可視吸収、EPR、Stopped-flow、酸化還元電位測定により解析する。さらに生体膜の非常に良いモデルであるナノディスク環境中に1分子の101F6タンパク質を再構成させた状態でのこれらの測定・解析を行う予定である。同時により詳細な分子機構を理解するためには高分解能X線結晶構造の情報が不可欠である。このため、Lipidic Cubic Phase(LCP)法を用いた高純度結晶の作成に挑む。

次年度使用額が生じた理由

(理由)H29年度に101F6タンパク質の高純度結晶の作成を目指していたが、野生型101F6タンパク質の発現と精製が計画通りに進行しなかったため、LCP法による結晶化に要する研究費使用を後年度に回すことにした。
(使用計画)H30年度において、当初の計画通りにH29年度分の研究内容(野生型101F6タンパク質の発現と精製、LCP法による結晶化)を進展させる予定である。

  • 研究成果

    (15件)

すべて 2018 2017

すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (11件)

  • [雑誌論文] Reaction Intermediates of Nitric Oxide Synthase from Deinococcus radiodurans as Revealed by Pulse Radiolysis: Evidence for Intramolecular Electron Transfer from Biopterin to FeII-O2 Complex2018

    • 著者名/発表者名
      Yuko Tsutsui, Kazuo Kobayashi, Fusako Takeuchi, Motonari Tsubaki, and Takahiro Kozawa,
    • 雑誌名

      Biochemistry

      巻: 57 ページ: 1611-1619

    • DOI

      10.1021/acs.biochem.7b00887

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Mechanistic Insights into the Activation of Soluble Guanylate Cyclase by Carbon Monoxide: A Multi-Step Mechanism Proposed for the BAY 41-2272-Induced Formation of 5-Coordinate CO Heme2018

    • 著者名/発表者名
      Ryu Makino, Yuji Obata, Motonari Tsubaki, Tetsutaro Iizuka, Yuki Hamajima,Yasuyuki Kato-Yamada, Keisuke Mashima, and Yoshitsugu Shiro
    • 雑誌名

      Biochemistry

      巻: 57 ページ: 1620-1631

    • DOI

      10.1021/acs.biochem.7b01240

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Study on the Photoinduced Nitric-Oxide-Releasing Ability of 4-Alkoxy Furoxans2017

    • 著者名/発表者名
      Matsubara Ryosuke、Takazawa Saori、Ando Akihiro、Hayashi Masahiko、Tohda Rei、Tsubaki Motonari
    • 雑誌名

      Asian Journal of Organic Chemistry

      巻: 6 ページ: 619-626

    • DOI

      10.1002/ajoc.201700030

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Photosensitization of fluorofuroxans and its application to the development of visible light-triggered nitric oxide donor2017

    • 著者名/発表者名
      Christopher Peter Seymour, Rei Toda, Motonari Tsubaki, Masahiko Hayashi and Ryosuke Matsubara
    • 雑誌名

      J. Org. Chem.

      巻: 82 ページ: 9647-9654

    • DOI

      10.1021/acs.joc.7b01709

    • 査読あり
  • [学会発表] 線虫Cytochrome b561ホモログ・Cecytb-2の分子機能解明 (Elucidation of the molecular function of Caenorhabditis elegans Cecytb-2, a cytochrome b561 homologue)2017

    • 著者名/発表者名
      Mika Fujimura, Masahiro Miura, Tetsunari Kimura, Motonari Tsubaki
    • 学会等名
      第55回日本生物物理学会年会(熊本大学・黒髪北キャンパス、熊本県)
  • [学会発表] 金属還元酵素ヒトSteap3の分子機能解明(Analyses on the molecular function of metalloreductase human Steap3)2017

    • 著者名/発表者名
      中田 壮人, 藤村 美香, 武内 総子, 鍔木基成
    • 学会等名
      第55回日本生物物理学会年会(熊本大学・黒髪北キャンパス、熊本県)
  • [学会発表] 放射線耐性菌一酸化窒素合成酵素の酸素活性化反応中間体に関する研究 (Direct Observation of an active intermediate in nitric oxide synthase from Deinococcus radiodurans as revealed by pulse radiolysis)2017

    • 著者名/発表者名
      筒井 裕子, 小林 一雄, 武内 総子, 鍔木 基成, 古澤 孝弘
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会(ConBio2017) (神戸ポートビアホテル、神戸国際会議場、兵庫県)
  • [学会発表] Cytochrome b561ホモログ・線虫Cecytb-2の分子機能解明 (Elucidation of the molecular function of Caenorhabditis elegans Cecytb-2, a cytochrome b561 homologue)2017

    • 著者名/発表者名
      藤村美香、三浦雅央、木村哲就、鍔木基成
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会(ConBio2017) (神戸ポートビアホテル、神戸国際会議場、兵庫県)
  • [学会発表] 金属還元酵素ヒトSteap3の分子機能解明2017

    • 著者名/発表者名
      中田壯人、藤村美香、武内総子、鍔木基成
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会(ConBio2017) (神戸ポートビアホテル、神戸国際会議場、兵庫県)
  • [学会発表] 線虫Cytochrome b561ホモログCecytb-2のアスコルビン酸からの電子伝達機能2017

    • 著者名/発表者名
      福澤美咲、藤村美香、三浦雅央、鍔木基成、木村哲就
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会(ConBio2017) (神戸ポートビアホテル、神戸国際会議場、兵庫県)
  • [学会発表] 線虫Cysteine desulfuraseの生理機能解析2017

    • 著者名/発表者名
      大塚瑞樹、鍔木基成
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会(ConBio2017) (神戸ポートビアホテル、神戸国際会議場、兵庫県)
  • [学会発表] Elucidation of apoptosis mechanism caused by human tumor suppressor 101F6 protein through vitamin C-induced redox disturbance2017

    • 著者名/発表者名
      Mohammed El Behery, Takako Yamazoe, Akikazu Asada, Mika Fujimura, Motonari Tsubaki
    • 学会等名
      2017年度生命科学系学会合同年次大会(ConBio2017) (神戸ポートビアホテル、神戸国際会議場、兵庫県)
  • [学会発表] 金属還元酵素ヒトSteap3の分子機能解明2017

    • 著者名/発表者名
      中田壯人、藤村美香、武内総子、鍔木基成
    • 学会等名
      若手フロンティア研究会2017、神戸大学研究基盤センター
  • [学会発表] 線虫Cytohrome b561ホモログCecytb-2分子機能解析2017

    • 著者名/発表者名
      福澤美咲、藤村美香、三浦雅央、木村哲就、鍔木基成
    • 学会等名
      若手フロンティア研究会2017、神戸大学研究基盤センター
  • [学会発表] ABCトランスポーターのヘム輸送機構解析2017

    • 著者名/発表者名
      林沙英、杉本宏、城宜嗣、池本夕佳、鍔木基成、木村哲就
    • 学会等名
      若手フロンティア研究会2017、神戸大学研究基盤センター

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公開日: 2018-12-17  

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