| 研究課題/領域番号 |
16K07323
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
鍔木 基成 神戸大学, 理学研究科, 教授 (00145046)
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| 研究分担者 |
木村 哲就 神戸大学, 理学研究科, 特命講師 (70506906)
武内 総子 神戸大学, 大学教育推進機構, 助教 (00448169)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 膜タンパク質 / 電子伝達 / ヘム / アポトーシス / ナノディスク / シトクロムb561 / アスコルビン酸 / 生体膜 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト染色体3p21.3領域に存在する101F6遺伝子は顕著な癌抑制作用を示す事が知られているが、その分子機構については不明である。101F6遺伝子産物は2個のヘムｂを含有する膜貫通型タンパク質であり、 b561ファミリーの一員であることから、アスコルビン酸(AsA)あるいはモノデヒドロアスコルビン酸(MDA)ラジカルが関与する生体膜貫通レドックス反応がその生理機能発現に深く関与していると思われる。本研究ではAsA/MDAラジカルによる生体膜内外でのレドックス擾乱をプログラム細胞死へと導く細胞内メッセージとして捉え、その細胞死シグナルを生体膜（ER膜）において発生・制御する素子としての101F6タンパク質の役割と分子機構を解明することを目的としている。我々はメタノール資化性酵母Pichia pastorisによる101F6タンパク質発現系を用い、大量発現系と高純度精製方法を確立した。並行して、ヒト癌組織由来のA549細胞を培養し、界面活性剤DDMあるいはβ-OGにより細胞抽出液を調製・回収した。細胞抽出液と精製101F6タンパク質を充分に混和した後、101F6タンパク質を特異的に認識・結合する抗体を用いた磁気beads抗体法により、101F6タンパク質と相互作用すると思われるいくつかのタンパク質をSDS-PAGEと銀染色法で解析した。この解析方法のように、101F6タンパク質が界面活性剤とのミセル状態のままでは、高純度精製したタンパク質を使用しても必ずしも生体膜中でのタンパク質間相互作用あるいは酵素反応を反映していない可能性が考えられた。そこで生体膜の非常に良いモデルであるナノディスク環境中に101F6タンパク質を再構成させた状態で免疫沈降・酵素反応を解析する計画を進めた。その結果、101F6タンパク質を効率的に小さなサイズのディスク中に安定的に再構成する事に成功した。
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