| 研究課題/領域番号 |
16K07332
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
広瀬 恵子 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (90357872)
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| 研究期間 (年度) |
2016-10-21 – 2019-03-31
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| キーワード | 分子モーター / 微小管 / 鞭毛・繊毛 / 電子顕微鏡 / 生物物理 / DNA折り紙 |
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| 研究実績の概要 |
軸糸外腕ダイニン分子は、微小管上に規則的に結合し、負荷に応じて力発生機能を調節することによって鞭毛・繊毛の周期的屈曲運動に働く。本研究では、二本の微小管の間に外腕ダイニン分子が規則的に並んだ複合体を作成し、ここに微小管同士を架橋する構造を付加することにより運動中の複合体の解離を防ぎ、力発生中のダイニンを急速凍結して電子顕微鏡観察できるような系の構築を目指している。
まず、クラミドモナス鞭毛から抽出した軸糸外腕ダイニンを、in vitroで重合した微小管に結合させて複合体を作成し、二本の微小管の間にダイニンが一列に規則的に並ぶような条件を検討した。このような複合体にATPを加えたときに、実際に微小管同士の滑り運動が起こることを、蛍光顕微鏡を用いて観察した。ATP添加後、瞬時に微小管の滑り出しが起こるため、Caged ATPを用いることにより、運動を観察することができた。
さらに、力発生時に微小管が滑り合って複合体が解離するのを防ぐため、複合体を構成する微小管同士を架橋する構造体を、DNA折り紙法を用いて作成した。長さ80 nm程度の棒状のDNA折り紙構造体をデザインし、これを複合体の微小管に結合させることにより、架橋構造の位置を電子顕微鏡で明確に観察できるような系を作成することができた。このような架橋構造により、ATPを加えた時に起こる複合体の解離を防ぐことができるかを蛍光顕微鏡および電子顕微鏡で確認した。微小管とダイニンの割合を変えて条件検討し、複合体中のダイニン分子の数が少ない時には複合体構造が保たれることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
作成したダイニン・微小管複合体が微小管滑り運動を起こすことを確認するため、in vitro運動アッセイを行ったが、安定した滑り運動の観察が予想以上に困難だったため、進捗がやや遅れている。しかし、ダイニンの精製方法や運動アッセイの方法に工夫を重ねることにより、運動が観察できるようになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
架橋に用いるDNA折り紙が、微小管により強固に結合するように、結合方式を検討し、ダイニンの濃度をある程度上げても複合体が解離しないような系をつくる。架橋した複合体でダイニンによる微小管の運動が起こることを、ナノ計測によって確かめる。このような複合体の構造を固定し、電子顕微鏡で観察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度、追加採択（2016.10.21-）で開始が半年以上遅れたため、未使用額がかなり発生した。当該年度は研究補助員を週一日雇用する予定であったが、必要な技術をもつ人材が見つからなかったため、次年度に繰り越し、研究補助員を週1－２日程度雇用して研究を加速する計画である。
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