| 研究課題/領域番号 |
16K07338
|
|---|
| 研究機関 | 筑波大学 |
|---|
研究代表者 |
中野 賢太郎 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (50302815)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
|
| キーワード | 繊毛虫 / 原生生物 / 細胞質分裂 / アクチン / ミオシン / 微小管 |
|---|
| 研究実績の概要 |
今年度は、テトラヒメナが有するユニークなアクチン遺伝子 tARP の遺伝子破壊株の作製に成功した。tARP 遺伝子破壊株は、細胞の遊泳速度が有意に低下したが、野生株と同様に細胞増殖できた。これより、テトラヒメナがコンベンショナルなアクチン以外のアクチン様蛋白質を用いて分裂する可能性を排除できた。また我々が薬剤スクリーニングで目星をつけた細胞分裂に働く蛋白質キナーゼ群について、新たに４つの細胞内局在性を調べるためにGFP 発現細胞の作成を試みた。その結果、４つのうち２つについてGFP 導入株が得られたものの、GFP コンストラクトを発現誘導すると速やかに細胞増殖が停止することが分かった。そのため、目的のキナーゼの細胞内局在性を確認するには至っていない。しかし、これらのキナーゼが細胞内で重要なシグナル伝達経路を制御している可能性が示唆された。別の２つは、GFP 導入株の確認をしている段階である。昨年度に BB に局在するのを見出した２つのキナーゼについては、遺伝子破壊株の作製を進めた。まず試みた somatic KO 法ではこれらの遺伝子破壊株を得ることができなかったため、両キナーゼは細胞増殖に必須な機能を担うことが期待された。
また、生細胞の経時観察系の確立とロトキネシスの研究について、 ABiS の研究支援課題として継続し、細胞の繊毛運動波形を高時間分解能且つ高空間分解能での計測系の改良を進めた。特に、特殊微細加工を加えた石英薄板上に細胞をトラップして観察する系を用いて、細胞表層の繊毛運動を数分間にわたって観察することができたのが大きな進歩である。
昨年度報告したCMB1 の経路とは別に細胞分裂面を決定するしくみを探るため、低分子量 GTPase のシグナル伝達経路の関与を期待し、GFP 発現細胞及び遺伝子破壊株の作製を試みているが、全て途中段階である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
解析が遅延した大きな原因は、遺伝子組換えコンストラクトの構築の効率が十分に改善されていないこと、また導入した GFP の蛍光が弱く観察しにくかったこと等が挙げられる。導入用コンストラクトの構築に用いる PCR プライマーの設計の工夫や、GFP を高発現する細胞株をクローニングすることで、これらの改善を引き続き試みる。In-fusion を用いたクローニングシステムが比較的によく動いているため、PCRベースでのコンストラクトの構築から、In-fusion クローニングシステムに切り替えることも考えにいれている。またベンチャー企業の協力を得て実施したテトラヒメナを１細胞ずつ単離・培養する系はうまく作動したが、機器を継続して借用することができず、ルーチンに動かせなかったことも効率化に至らなかった原因である。また、ABiS の研究支援課題である細胞の繊毛運動波形を高時間分解能且つ高空間分解能での計測については、従来よりも明瞭な繊毛運動波形の記録取得に成功したが、このチャンバーでは微分干渉法や位相差法などが利用できない光学的問題が浮上した。そのため、ロトキネシス時の繊毛運動の波形パターンを計測できなかった。チャンバーの構造を見直すなどの回避手段を検討している。
またアルベオラーサックの分配機構を調べるために行ったTCBP25-GFP細胞株の作製には未だ成功していない。引き続きリンカー配列や発現量を検討し、克服を目指している。
|
| 今後の研究の推進方策 |
テトラヒメナのユニークな細胞質分裂の分子機構を探るため、これまでに我々が薬剤スクリーニングで見出した細胞分裂に働く蛋白質キナーゼ群について、さらに解析対象とする遺伝子を増やし、引き続き局在解析を進める。また前年度に明らかにした、基底小体に局在するキナーゼをコードする遺伝子の破壊実験が somatic KO 法ではできなかったため、時間はかかるが確実に遺伝子破壊株の終末表現形を観察できる germline KO 法を進めることで、この実験を完遂する。そして、それらキナーゼの細胞質分裂への必要性を明らかにする。より簡便にキナーゼ機能を失った細胞の表現型を検討するため、発現制御可能な MTT2 プロモーターを用いたドミナントネガティブ型キナーゼの発現実験を進める。また、ABiS や企業の協力のもと、細胞表層の繊毛運動や分裂溝表層の変化を高分解能で効率良く観察可能な系の構築を進める。さらに脱繊毛した細胞で、分裂細胞のカルシウムイオン変化を計測するためのイメージングを進める。
またテトラヒメナの細胞表層全体に分布する基底小体の中から、分裂領域の基底小体が分裂期特異的に選択されるための分子経路を明らかにするため、これまで解析していた GFP-CMB1 発現細胞には見切りをつけて、MOR-NDR 経路の機能解析に注力する。上記の MTT2 プロモーターを用いたドミナントネガティブ型キナーゼの発現実験系を利用したいと考えている。
さらにアルベオラーサックの分配機構を調べるために、TCBP25-GFP とは別に、RAB ファミリー低分子量 GTPase の研究を進めており、これらの GFP コンストラクトを用いてAS の細胞分裂時の動態を顕微鏡観察するための細胞株を樹立する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究を遂行するために雇用していた者が病気で欠勤したため、人件費が１万円ほど支払う必要がなくなってしまったことなどによる。この分は、今年度に人件費あるいは物品費として有効に活用させていただきたい。
|
