| 研究課題/領域番号 |
16K07338
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
中野 賢太郎 筑波大学, 生命環境系, 教授 (50302815)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | テトラヒメナ / 細胞質分裂 / アクチン / ミオシン / 微小管 |
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| 研究実績の概要 |
今年度は遺伝子導入ベクターと形質転換方法の改良を重ね、これまでよりも効率よく研究を進めることができた。その代表的な成果として、動物細胞や酵母などのオピストコンタの細胞質分裂時にはたらくフォルミンについて、そのテトラヒメナのホモログ（BNI1）の分裂溝への細胞内局在性を詳細にしたことが挙げられる。BNI1は細胞周期を通じて基底小体 BBに局在するが、大核分裂が始まる時期に細胞の分裂面に集積を始め、分裂溝の陥入が顕著になるにつれて、その集積が著しく増加した。アクチン重合阻害剤で処理しても分裂溝のBNI1の局在は維持された。従って、アクチン繊維とは関係なく、BNI1が細胞質分裂に寄与することが期待された。現在、BNI1 の遺伝子破壊株の作成を進めている。
一方、我々が薬剤スクリーニングで目星をつけた細胞分裂に働く蛋白質キナーゼ群についても、上記の遺伝子発現系の改良の結果、解析が大きく前進した。前年度までに分裂溝の進行を阻害する薬剤の標的と推定されるキナーゼのうち、２つが BB に局在することを発見した。これらのキナーゼについては、ドミナントネガティブ変異体を作成し、それぞれをテトラヒメナ野生株に発現した。その結果、薬剤処理した細胞と同様に分裂溝の陥入が抑制された表現型を呈するのが観察された。これより、テトラヒメナの細胞質分裂の進行に必要な蛋白質キナーゼをコードする遺伝子を単離できたと思われる。また、同キナーゼ遺伝子群の別の４つの遺伝子の産物については GFP による局在解析を完了できた。これらのうち３つは細胞周期を通じて BB に局在したため、先の２つの遺伝子産物と重複する機能を担っている可能性が考えられた。他の１つについては、特定の時期にだけ大核内に集積するのが認められた。以上の４つの蛋白質キナーゼ遺伝子についてはドミナントネガティブ変異を導入し、細胞に発現する準備を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度は遺伝子組換えコンストラクトの構築が比較的によく進められた。方法の改良を重ねたことと、研究に従事する学生の手技が磨かれたことなどが要因と考えられる。またGFP の蛍光が弱かったため、別の自家蛍光蛋白質である mCherry を用いたり、発現プロモーターの種類を変えるなど、より局在を観察するのに適した改良を加え、さらに効率よく研究を進める工夫を続けている。また、これらのマーカー蛋白質と目的遺伝子産物の間のリンカー配列についても検討を進めている。但し、先の２年間に遺伝子組換え実験の作成効率が高くなく、研究計画の進行状況が良いとはいえなかった。そのため、全体として判断するならば、進捗状況は遅れ気味であると判断するのが妥当といえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
上述した BNI1 の遺伝子破壊株の表現型を特定する。もしBNI1 の遺伝子破壊株が細胞質分裂に重篤な異常を示すようであれば、次の実験を行う。まず、BNI1 の機能ドメインを同定するため、その遺伝子のトランケートシリーズを用意し、細胞に発現させる。その結果、分裂溝への局在に必要なドメインと、過剰発現時に細胞質分裂に異常をもたらすドメインを調べる。その結果、BNI1 の細胞機能ドメインを明らかにできるだろう。さらにそのドメインと相互作用する因子を、GFP 結合蛋白質（GBP）でプルダウンし、同定する。以上より、テトラヒメナの分裂溝の膜直下ではたらく蛋白質複合体を解明する計画である。
なお BNI1の動物細胞ホモログは、Rho ファミリー低分子量 GTPase の下流ではたらく。そこで、テトラヒメナの Rho ホモログの機能解析を進める。既に、局在解析用と機能解析用の遺伝子コンストラクトは用意できたので、細胞に導入して解析を進める。
一方、薬剤スクリーニングで見出した細胞分裂に働く蛋白質キナーゼ群については、局在解析の結果をまとめ、ドミナントネガティブ型変異体の発現により、その機能が細胞質分裂に必要か判定する目処がつきつつある。この研究成果について論文発表の準備を進める。同様のアプローチで、細胞分裂に働く別の蛋白質キナーゼ群についても、その局在性と機能を探る計画である。以上より、細胞表層全体に分布する基底小体の中から、分裂領域の基底小体が選択されるための分子経路を調べる。
また遺伝子組換え実験の効率が上がったため、滞っていたアルベオリンや膜の動態制御に働く Rab ファミリーの低分子量 GTPase などのうち AS に特異的に局在化するものを標的にし、AS の細胞分裂時の動態を顕微鏡観察するための細胞株を樹立する計画である。
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