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2016 年度 実施状況報告書

細胞間コミュニケーションにおけるコンタクトアクティベーション機構の解析

研究課題

研究課題/領域番号 16K07343
研究機関東京農工大学

研究代表者

斉藤 美佳子  東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (20291346)

研究期間 (年度) 2016-10-21 – 2019-03-31
キーワードコンタクトアクティベーション / Cx30.3 / マウスES細胞 / 細胞間コミュニケーション
研究実績の概要

マウスES細胞において、ギャップジャンクション構成タンパク質であるコネキシン群の網羅的解析により、Cx30.3が隣接する細胞間接触部位のみに速やかに発現することを見いだしており、Cx30.3はコンタクトアクティベーションの機能を有する分子であると考えられている。本研究は、このCx30.3タンパク質の新機能を明らかにすることにより、多細胞生物の多様な細胞間コミュニケーションの分子機構を解明することを目的としている。本年度は、Cx30.3のES細胞内発現動態の解析を行なうために、以下の2点を行った。

1.Cx30.3遺伝子のプロモーター領域の解析
データベースを元にES細胞からプロモーター領域と予想されるゲノムDNAを抽出し、EGFPをレポーターとするベクターを数種類作製した。それらのベクターをES細胞にトランスフェクションし定量PCR法によりEGFPのmRNA発現量を解析した。その結果、プロモーター活性を有する部位を決定することができた。
2.Cx30.3タンパク質の細胞接触に伴う空間的発現解析
Cx30.3とEGFPの融合タンパク質発現ベクターをES細胞へトランスフェクションし、Cx30.3-EGFP発現ES細胞を作製した。2個のCx30.3-EGFP発現ES細胞同士をマニピュレーターを用いて接触させたところ、速やかに接触点に向かって移動するEGFPの蛍光スポットが確認された。2個のCx30.3-EGFP発現ES細胞を一旦接触させたのち、細胞を強制的に離したところ、細胞接触面から速やかに遠ざかるEGFPの蛍光スポットが確認された。一方、Cx30.3-EGFP発現ES細胞と異種細胞であるHeLa細胞を接触させた場合は、それに伴う蛍光スポットの移動は全く観察されなかった。これらのことから、Cx30.3は同種のES細胞接触を認識しているのではないかと考えられた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

初年度である本年度の目的はCx30.3遺伝子のプロモーター領域の解析である。データベースを元に設計したDNAにEGFPをレポーターとするベクターを数種類作製した。ES細胞にトランスフェクションした細胞のEGFPのmRNA発現量の定量PCR解析により、プロモーター活性を有する部位を決定することができた。今後解析予定の転写因子の探索のためには、プロモーターの最小領域の決定が必要であるため、現在解析を進めている。
また、平成30年度に実施予定である、Cx30.3タンパク質の時空間的発現解析の予備実験として、Cx30.3タンパク質の細胞接触に伴う空間的発現解析を行い、Cx30.3タンパク質の新たな機能を有する可能性を見いだすことができた。

今後の研究の推進方策

初年度に実施予定であったCx30.3遺伝子のプロモーター解析について、概ねの領域を決定することができたが、転写因子探索のため、プロモーターの最小領域を決定する。
その結果を基に、Cx30.3遺伝子のプロモーターの最小領域に結合する転写因子を、ストレプトアビジンにビオチン標識したDNAを結合させた磁気ビーズを用いて探索する。
さらに、Cx30.3タンパク質の時空間的発現解析として、既にCx30.3タンパク質がES細胞同士の接触よりその接触部位に移動する様子を確認しているが、Cx30.3を発現した異種細胞および他のコネキシンが発現した異種細胞との接触応答についても解析を行う。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2017 その他

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件、 謝辞記載あり 1件) 学会発表 (2件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Connexin30.3 is expressed in mouse embryonic stem cells and is responsive to leukemia inhibitory factor2017

    • 著者名/発表者名
      Mikako Saito, Yuma Asai, Keiichi Imai, Shoya Hiratoko, Kento Tanaka
    • 雑誌名

      Scientific Reports

      巻: 7 ページ: -

    • DOI

      10.1038/srep42403

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [学会発表] Cx30.3のES細胞における特異機能2017

    • 著者名/発表者名
      平床聖也, 岸 亮太, 徳永成和, 斉藤美佳子
    • 学会等名
      電気化学会
    • 発表場所
      首都大学東京(東京都八王子市)
    • 年月日
      2017-03-27
  • [学会発表] 細胞内ナノ空間動態解析のための光顕-電顕イメージング照合法の開発2017

    • 著者名/発表者名
      平床聖也, 福場郁子, 加治木泰範, 楯 真一, 斉藤美佳子
    • 学会等名
      電気化学会
    • 発表場所
      首都大学東京(東京都八王子市)
    • 年月日
      2017-03-27
  • [備考] 東京農工大学工学部生命工学科斉藤研究室ホームページ

    • URL

      http://web.tuat.ac.jp/~msaito/

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公開日: 2018-01-16  

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