| 研究課題/領域番号 |
16K07358
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| 研究機関 | 高崎健康福祉大学 |
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研究代表者 |
常岡 誠 高崎健康福祉大学, 薬学部, 教授 (50197745)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ヘテロクロマチン / リボソームRNA遺伝子 / HP1 / KDM2A / クロマチン構造 / 転写 |
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| 研究実績の概要 |
ヘテロクロマチン構成タンパク質HP1がrDNA promoterクロマチン構造に与える影響を検討するために、脱メチル化酵素KDM2AによるrRNA転写調節機構に焦点を当てた。我々はKDM2AがHP1γと直接結合することを明らかとしたが、その生理機能への影響は不明であった。今回HP1と結合しないKDM2Aの作製・高発現細胞の樹立及びHP1γのKDにより、HP1γはグルコース飢餓時のKDM2AによるrRNA転写抑制に必要であることが分かった。HP1γのKDはrDNA promoter上でのKDM2Aの基質であるH3K36me2脱メチル化を抑制したことから、HP1γはrDNA promoterのKDM2A活性によるクロマチン構造変化に必要であることが示唆された。
2つ目の項目として、KDM2A産物がヘテロクロマチン-ユウクロマチンのクロマチン構造の転換に関与している可能性について検討した。KDM2A遺伝子からはKDM2A蛋白質のほかに脱メチル化酵素活性を持たないSF-KDM2A蛋白質が作られる。SF-KDM2AはrDNA promoter上の転写抑制（ヘテロクロマチン）のマークであるH4K20me3を減少させ、rDNA転写を上昇することを昨年報告した。本年はこのSF-KDM2Aによる変化がrDNA promoter上でのヘテロクロマチンからユウクロマチンへの転換と関係する可能性を検討した。そこでSF-KDM2Aの発現を比較的長期間抑制し、rDNA promoterでのDNAのメチル化CpG量をバイサルファイト法により測定した。プレリミナリーな結果ではあるが、SF-KDM2A KDがDNAメチル化を増加させる傾向が観察された。以上から、KDM2A遺伝子産物がrDNA promoterのクロマチン構造に複数の方法で影響を及ぼすことが分かってきた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１、HP1によるKDM2A機能調節：昨年までに、HP1とKDM2Aが結合すること、KDM2A中の特定のアミノ酸配列（Val801を中心とするアミノ酸配列）を介して、HP1と直接結合することが明らかにされていた。本年はHP1との結合を失った変異KDM2Aまたは野生型KDM2Aを高発現する細胞を作製し、性質を調べ、HP1がrDNA promoterのクロマチン構造及びrRNA転写調節に関与することを明らかにした。研究は計画通り進んでいる。
２、SF-KDM2Aによるクロマチン構造の転換：ヘテロクロマチン－ユウクロマチンの転換とSF-KDM2A関連する可能性が示唆された。昨年までの研究でH4K20me3の量をSF-KDM2Aが調節し、rRNA転写に影響することが示唆されたが、Suv4-20hの関与については証明できていない。本年はこの変化にSuv420hが関係するかを確認するため、Suv420h inhibitor を入手し検討した。その結果、このinhibitorはSF-KDM2A KDによるrRNA転写抑制を回復し、SF-KDM2AがSuv420hの活性を抑制することで、rRNA転写を上昇することが示唆された。しかし一方で、培養条件を変えることで、SF-KDM2AのrRNA転写への影響がは変化することが分かってきた。すなわち低血清濃度にするとSF-KDM2AがrRNA転写抑制活性を示すことがあった。このことはSF-KDM2A研究で一定の結果が得にくかったことを説明する。今後、まず培養条件を厳密に調節することにより、SF-KDM2Aの活性発揮を正確に記載すること、続いて上記inhibitor及びSuv420hのsiRNAを活用し、SF-KDM2A Suv420hによるクロマチン構造調節機構を明らかにしたい。計画通りではないが、今後の研究の発展が期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
１、HP1によるKDM2A機能調節：本年はまず論文を仕上げることを優先させる。また、KDM2Aの酵素活性のみでは、rRNA転写抑制に十分でないことが分かってきた。今後、酵素活性がどの段階でどのようにクロマチン構造変化に作用するのか、また酵素活性発揮以降のKDM2Aのクロマチン構造への影響について検討していく。またHP1γをKDすることのみにより、KDM2Aが核小体から核質に拡散する傾向が観察された。この傾向はKDM2AへのHP1γと結合しない点突然変異導入よりも強かった。このことはHP1γはKDM2Aとの直接的な結合以外の機構を介してKDM2Aを核小体に集積させている可能性を示唆する。核内局所でのタンパク質の集積量の変化は局所でのクロマチン構造に大きく影響すると考えられる。そこでこの現象の詳細を検討する。
２、SF-KDM2Aによるクロマチン構造の転換： 培養条件の検討を行う。現在までのところ、培養液中の血清濃度がSF-KDM2Aの機能に影響することが示唆されてきた。そこで、培養液中の因子の探索及び関連が予想されるシグナル伝達系を探索する。そしてSF-KDM2A機能が明確に測定できる条件で、SF-KDM2A作用におけるSuv420h関与の機構を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
SF-KDM2Aの核小体周辺への集積に関係する因子の同定により得られた候補因子のなかからさらに候補を絞り込むのに時間を要した。また、HP1γをKDすることにより、KDM2Aが核小体から核質に拡散する傾向を示したが、この現象の一般性を調べることとした。以上の理由で新規の実験材料を購入するため、予算を次年度に回した。
複数の核小体タンパク質 核質タンパク質の抗体及びcDNAを入手する。本研究の解析に必要なsiRNA、transfection 試薬、抗体等を購入する。
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