| 研究課題/領域番号 |
16K07376
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
梅園 良彦 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (20391881)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | FGFシグナル |
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| 研究実績の概要 |
平成30年度においては、継続してアフリカツメガエル胚を活用し、アフリカツメガエル FGF受容体 (FGFR) のIgドメインをプラナリアFGFR（DjFGFR2）のIgドメインで入れ換えたキメラ受容体をコードするmRNAおよびDjfgf mRNAをアフリカツメガエル受精卵に顕微注入し、アニマルキャップを用いてアフリカツメガエルFGFシグナル経路の標的遺伝子であるXbraの発現誘導能を定量RT-PCRにより解析することによって、DjFGFR2のIgドメインとDjFGFとの相互作用の有無を検定した。
Djfgfについては、コードしているタンパク質の系統樹解析をおこなった。whole mount in situ hybridization法を用いて、プラナリア再生過程におけるDjfgfの発現解析をおこない、発現細胞種も同定した。プラナリア再生過程におけるDjfgfの発現制御機構に関する解析をおこなった。また、脊椎動物培養細胞を用いたアッセイ系により、リコンビナントDjFGFが活性を有するかどうかをERKタンパク質のリン酸化の有無で検定をおこなった。最後に、リコンビナントDjFGFを活用したプラナリア成体における機能獲得型の実験系の確立にも挑戦した。
これまでの解析結果から、NDL-2はDjFGFと結合可能であること、ndl-2の前方発現の勾配パターンはNDKにより制御されていることなどがわかってきた。すなわち、NDKはndl-2の発現制御を介して細胞外におけるDjFGFの勾配を形成している可能性が考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度においては、DjFGFR2の開始Metを含むcDNAをクローニングすることができていなかったが、今年度は問題を解決し、キメラ受容体をコードするmRNAを合成することに成功し解析を進めることができた。しかしながら、新しい親カエルを購入し実験に使用したところ、実験結果の再現性が非常に不安定となり、データ取得が非常に困難な状況となってしまった。そのために、１年間の研究期間延長申請おこなうことで、アッセイ方法自体を再検討することにした。また、プラナリア再生過程におけるDjfgfの発現解析から、Djfgfは切断後に既に存在している一群の分化細胞由来で、一過的に頭部再生に関連してERKシグナル依存的に発現すること、また、その発現は幹細胞の増殖に関連している可能性が新たにわかった。リコンビナントDjFGFを活用した機能獲得型の実験系として、ビーズを使用したプラナリア生体移植が可能であることがわかった。しかしながら、長期間（３日間以上が理想）の移植は未だ困難であるため、成功率をあげるための技術的訓練を継続中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
複数の親カエルをさらに試すことによって、継続してDjFGFR2のIgドメインとDjFGFとの相互作用の有無を検定する。また、ビーズ移植による機能獲得型の実験系の確立を目指すとともに、新たに、エレクトロポレーションによる遺伝子導入法の確立も目指す。すでに他動物を用いてエレクトロポレーションによる遺伝子導入は成功しているため、その方法を参考に条件検討をおこなう。これまでに、プラナリアにおいては、機能獲得型の実験系はほぼ皆無であるため、世界に先駆けて新境地を開拓できることを期待している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験トラブルの発生のため、全体的に研究スケジュールが少し遅延したため、本来使用するはずであった消耗品費の一部を残し、期間延長申請をおこなった。主な使用計画としては、アフリカツメガエル胚を用いてDjFGFR2のキメラ受容体とDjFGFとの相互作用を調べるために要する試薬などの消耗品代に充当する。また、すでに一部は、解析に絶対欠かせないqRT-PCRマシンが故障してしまったため、修理代に当てた。
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