| 研究課題/領域番号 |
16K07378
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| 研究機関 | 学習院大学 |
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研究代表者 |
谷口 喜一郎 学習院大学, 理学部, 助教 (20554174)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | アポトーシス耐性 / カスパーゼ / ショウジョウバエ |
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| 研究実績の概要 |
1. 唾液腺・附属腺・脂肪体・後腸におけるアポトーシス耐性
ショウジョウバエにおけるアポトーシスは、細胞傷害に応答してアポトーシス誘導因子群RHGの発現が誘導され、カスパーゼカスケードが活性化することで引き起こされる。一方で、附属腺・脂肪体といった倍加組織では、エフェクターカスパーゼDcp-1の発現が生理的に抑えられており、アポトーシス耐性を獲得していることを明らかにした。また、後腸においてはDcp-1の抑制に加え、下流因子の抑制も予想された。
一方で、本結論に至るための強制発現実験で用いた遺伝子誘導ドライバーが、組織ごとに誘導能に差がある (転写量の差) 可能性が示唆されたため、組織特異的な強いドライバーを用いて本結論を再検証することにした。解析の結果、附属腺・脂肪体・後腸におけるアポトーシス抑制制御点は、Dcp-1および下流因子 (後腸のみ) と示唆され、これまでの結論と矛盾は無かった。一方で、脂肪体については、低頻度ではあるが、上流のイニシエーターカスパーゼの強制発現でアポトーシスが誘導されることがあり、附属腺・後腸と比べ耐性能は低いと考えられた。
2. アポトーシス耐性の獲得ステージ
未分化細胞はアポトーシス感受性をもつと考えられており、アポトーシス耐性は発生・分化の過程で獲得されると考えられている。そこで、附属腺・脂肪体・後腸について、アポトーシス耐性の獲得がいつ起きるかを検証した。その結果、後腸は、未分化時においてはアポトーシス耐性を持たず、分化・倍加のタイミングでアポトーシス耐性が獲得されていることがわかった。一方で、附属腺では、サナギ期初期 (発生初期) の未分化時においてアポトーシス耐性がすでに獲得されていた。今後、運命決定時までさかのぼり検証を行い、獲得時期を調べる必要がある。脂肪体については、まだ十分な検証ができていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成28年度の研究計画は、1) 附属腺・脂肪体・後腸におけるアポトーシス耐性の獲得ステージを同定する、2) 発生シグナルとアポトーシス耐性獲得 (Dcp-1遺伝子の発現低下) の関係について検証の準備を開始する、であった。しかしながら、本研究計画における重要なポイントである“アポトーシス耐性制御点がDcp-1である”という結論に対して、確証を得るには不十分であった可能性が生じたため、再検証を行う必要性が生じた。
具体的には、強制発現実験において用いていた遺伝子誘導ドライバー (Actin>y+>Gal4) が附属腺・脂肪体・後腸において、誘導レベルが大きく異なる可能性が浮上した。そこで、各組織における特異的に誘導ドライバー (附属腺：prd-Gal4、脂肪体：r4-Gal4、後腸：byn-Gal4) を用いて再検証を行った。一方で、再検証においても、これまでの結論と一致する結果が得られたため、今後の計画に大きな変更はない。
本再検証により、“アポトーシス耐性の獲得ステージの同定”に関する実験計画の開始に遅れが生じたが、後腸・附属腺についてはステージの絞り込みがほぼ終了した。一方で、脂肪体に関しては検証が不十分であり、平成29年度において検証を続けていく必要がある。 また、“発生シグナルとアポトーシス耐性獲得”に関して、実験準備を開始する予定であったが、本計画についてもやや遅れが生じている。
以上のように、平成28年度に検証を終了させる予定であった実験が一部完了できていないという進捗状況を踏まえ、“やや遅れている”と自己評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度において計画に遅れが生じた“アポトーシス耐性の獲得ステージの同定”を早急に完了する。附属腺についてはサナギ期以前の附属腺細胞の運命決定時、脂肪体については幼虫期初期から胚発生後期に注目し、RHGによるアポトーシス誘導が可能となるステージ (アポトーシス耐性を持たないステージ) を同定する。
さらに、同定ステージにおいて活性化する発生シグナルに注目し、アポトーシス耐性獲得との関係を明らかにする。各発生シグナルを人為的に不活化したときに、アポトーシス耐性が失われるか (RHG強制発現によりアポトーシスがおこるか) について、免疫組織染色により調べる。さらに、各発生シグナルを人為的に活性化・不活化したときに、Dcp-1の発現量が変動するかどうか半定量RT-PCRにより調べる。一方で、分化シグナルではなく細胞状態の変化自体がアポトーシス耐性獲得に関係する可能性もある。分化シグナルとの相関が得られなかった場合は、細胞周期や細胞成長がアポトーシス耐性獲得の原因である可能性も考慮し、同様に検証を行う。
また、病理的に誘導されるアポトーシス耐性について検証をおこなう (当初は平成30年度の予定であったが、生理的アポトーシス耐性とのトランスクリプトーム比較をより効率的に行うために一部計画を変更)。アポトーシス耐性を持たない翅原器に対して染色体倍加異常誘導することで、病理的アポトーシス耐性を誘導する。強制発現実験によるアポトーシス制御点の同定、半定量RT-PCRによるアポトーシス関連遺伝子の発現量測定をおこない、附属線・脂肪体・後腸でみられた生理的アポトーシス耐性との比較をおこなう。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
消耗品の使用頻度により支出金額にわずかな余りが生じたたが、誤差の範囲であり使用計画の変更をともなうものではない。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記の通り、使用計画に影響を与える金額ではない。
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