| 研究課題/領域番号 |
16K07381
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| 研究機関 | 東京学芸大学 |
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研究代表者 |
笹土 隆雄 東京学芸大学, 教育学部, 研究員 (90511204)
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| 研究期間 (年度) |
2016-10-21 – 2020-03-31
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| キーワード | 始原生殖細胞 / 細胞移動 / ケモカイン / ヒト疾患関連遺伝子 / ヒト遺伝疾患 / 疾患モデル動物 |
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| 研究実績の概要 |
平成２９年度においてはメダカの飼育環境を整備し、ホールマウントin situハイブリダイゼーション、及び、突然変異体作製に必要な野生型を十分量取ることが出来る安定した環境を作ることが出来た。始原生殖細胞の移動に異常が見られる２種のメダカ突然変異体（kamigamo, shimogamo）について、これまでの遺伝学的な解析により、それぞれヒトに奇形を生じさせる先天性小児疾患の原因として知られる転写調節因子であることを突き止めているが、その原因遺伝子の始原生殖細胞の移動期胚における発現解析（ホールマウントin situハイブリダイゼーション）の為のプローブを現在作成中である。更に、先の大規模変異体スクリーニングにおいてshimogamo変異は１つしか取れていないので、これまで相補性検定による遺伝学的な確認が出来ていない。現在確認しているshimogamoの表現型がこの転写調節因子の機能不全が原因であることを確認する為に、CRISPR/Cas9システムによりノックアウトメダカを作製中である。同時に、shimogamo遺伝子についてはそれを一つしか持たない哺乳類とは異なり、メダカを含む小型魚類ではパラログがもう一つ存在する。そこで、この遺伝子も始原生殖細胞の移動に関わっているのかどうかを確認する為に、CRISPR/Cas9システムによりshimogamoパラログのノックアウトメダカを作製中である。更に、shimogamoパラログの発現解析に用いる為のホールマウントin situハイブリダイゼーション用プローブを作製中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本課題が一昨年度10月の追加採択で開始が遅れた上に、研究代表者の所属の異動による実験動物の飼育環境、及び、実験環境のセットアップに時間がかかり、当初の計画よりも遅れが生じている。
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| 今後の研究の推進方策 |
始原生殖細胞の移動に異常が見られ、かつその原因遺伝子がそれぞれヒト遺伝疾患に関る転写調節因子として知られる２種のメダカ突然変異体（kamigamo, shimogamo）について、引き続き以下の解析を行う。なお課題進捗の遅れについては、当研究の協力者との打ち合わせを頻繁に行ってアドバイスを受けながら、適宜外部企業による業務委託サービス等を有効に用いて進捗改善を図る。
・CRISPR/Cas9システムを用いてshimogamoノックアウトメダカを作製し、先の大規模変異体スクリーニングにおいて得られたshimogamo変異との相補性試験を行う。
・CRISPR/Cas9システムを用いてshimogamoパラログのノックアウトメダカを作製し、この遺伝子が始原生殖細胞の移動に関わっているのかどうかを調べる。
・始原生殖細胞の移動期において、shimogamoおよびそのパラログやkamigamo遺伝子が発現している組織を、ホールマウントin situ ハイブリダイゼーションによって調べる。
・転写調節因子と考えられるkamigamo、及び、shimogamoが、既知のケモカイン関連遺伝子の発現制御に関わっているのかどうかを調べる。つまり、これまでに始原生殖細胞の移動への関与が知られている既知のケモカインとその受容体遺伝子、cxcl12a/sdf1a、cxcl12b/sdf1b、cxcr4b、cxcr7等について、各変異体胚におけるそれぞれの遺伝子の発現を、ホールマウントin situハイブリダイゼーションによって調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）
本課題が一昨年度10月の追加採択で開始が遅れた上に、研究代表者の所属の異動による実験動物の飼育環境、及び、実験環境のセットアップに時間がかかり、当初の計画よりも遅れが生じた。その為、計画していた実験の一部を繰り越し、その経費を次年度に引き続いて使用することとした。
（使用計画）
前年度より持ち越した実験がある為に、この実験に必要な試薬・消耗品や共同研究遂行の為の旅費の一部として使用する。同時に、これまでに引き続いて、動物の飼育環境や研究環境のセットアップの充実の為に使用する。更に、課題進捗の遅れを取り戻す為に、当研究の協力者との打ち合わせを頻繁に行ってアドバイスを受けながら、適宜外部企業による業務委託サービス等を有効に用いる計画である。その為の打ち合わせ旅費や、業務委託の経費として使用する。
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