| 研究課題/領域番号 |
16K07382
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
坪内 知美 基礎生物学研究所, 幹細胞生物学研究室, 准教授 (70754505)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 多能性幹細胞 / DNA複製 |
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| 研究実績の概要 |
胚性幹細胞(ES細胞)を含む多能性細胞は、体を構成する全ての細胞種を生み出す能力をもつことから、再生医療への応用に期待が寄せられている。しかし、多能性細胞では遺伝情報を正確に維持するしくみが他の細胞種と異なっていることがわかってきている。多能性細胞の遺伝情報がどのように維持されていて、多能性維持や細胞死誘導とどのように連携しているのかを理解することは安全な再生医療に必須な知見をもたらすと考えられる。
本申請研究では、特にゲノムが不安定化しやすいDNA複製期に着目し、ES細胞におけるゲノム不安定化要因の特定、及び複製異常が起こった際の細胞応答を明らかにすることを目的としている。
H28年度までの解析でES細胞ではDNA複製期全体を通じてdNTPが不足しており、そのことでDNA複製フォーク速度が低下していると考えられた。H29年度は新規にdNTP量を測定する実験系を立ち上げ、ES細胞のdNTP量は線維芽細胞の約半分であることを明らかにした。興味深いことにγH2AXの局在は、dNTP前駆体（ヌクレオシド）の投与では減少しなかった。従って、DNA複製フォークの進行速度とγH2AXの出現頻度には直接的な相関がないことが明らかになった。
一方、ES細胞において、dNTP量が積極的に抑えられている理由は不明である。従ってヌクレオシドを投与した時のES細胞への影響を精査した。興味深いことに、ヌクレオシドの投与はDNA複製時に問題が生じた場合に染色体分配時に見られるUltra-Fine Bridgeの出現頻度を上昇させることがわかった。このことはdNTP量の増大により複製フォーク速度が上昇することは必ずしもES細胞を良好な状態ではないことを示唆する。つまり、ES細胞はdNTP量を低く保つことでDNA複製時の異常を回避していると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H28年度に計画した通り、DNA複製フォーク、γH2AX 出現頻度、dNTP量の関係性を明らかにした。予想に反してγH2AXはDNA複製フォーク速度やdNTP量と相関性が見られなかったが、 ES細胞においてdNTP量が制限されていることでDNA複製の精度を上昇させ、ゲノム恒常性の維持に貢献している可能性を新たに見出した。このことで多能性細胞の特徴がまた一つ明らかになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
dNTP量を低く保つための分子メカニズムを明らかにすると共に、dNTP量の増加時に生じるDNA複製中の問題を特定するべくいくつかの検証実験を行っている。H30年度前半にはこれらを完了し今年度中の論文投稿を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度においては頭初見込んだ申請額に近い金額の支出があったが、dNTP量の測定に見込まれた質量分析の費用が特に最初の実験調整ということで共同研究により無料で行われたため、予想していた追加の出費がなかった。dNTP 量そのものは蛍光オリゴを用いたDNA合成反応系を使って定量する実験系を新たに立ち上げることに成功したため、H29年度は主にそちらの実験系で進めることができた。ただし、H30年度はｄNTP産生制御にさらに踏み込んで理解を深めるために、質量分析によりdNTP産生経路の中間産物などの同定も行いたく、次年度に経費をもちこすことでこのことを可能にしたい。
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