| 研究課題/領域番号 |
16K07383
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
品川 敏恵 国立研究開発法人理化学研究所, 石井分子遺伝研究室, 専任研究員 (70344041)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 母性効果因子 / Zar1 / Zar2 / RNA結合因子 |
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| 研究実績の概要 |
受精からしばらくの間RNAの転写は起こらず、mRNA合成を阻害しても自律的に二細胞期へと発生が進行する。この間の胚発生は、受精前に卵子に蓄えられたRNAと蛋白質によって制御されていると考えられているが、その機構は良く分かっていない。卵子中の因子のうち、母方の遺伝子欠損のみで胚の初期発生に異常が見られるものは母性効果因子と呼ばれている。代表的母性効果因子であるzygote arrest 1 (Zaｒ1) は、受精後の接合子ゲノム活性化に必要なRNA結合蛋白質で、Zar1を欠損した卵子は野生型の精子と受精しても発生が二細胞期で止まってしまう。アフリカツメガエルのZar2 （Zar1-like） は母性ｍRNA Wee１の3’側の非翻訳領域にある翻訳調節配列に結合し、翻訳調節を行っていると考えられている。しかし、哺乳動物のWee1 mRNAにはこの翻訳調節配列に相同の配列が見当たらず、哺乳動物のZar1/Zar2がどのようなRNA配列を認識し、どのような種類のRNAを標的として接合子ゲノム活性化を制御しているのかは不明である。そこで今年度は、Zar1およびZar2の標的RNAを同定することを目的とした。NIH3T3細胞にZar1またはZar2を過剰発現させて細胞の抽出液をショ糖密度勾配で分画し、どのような種類のRNAに結合しているか調べたところ、Zar1とZar2は主にポリリボソーム画分にあるmRNAに結合していることが分かった。次に、RNA免疫沈降と次世代シークエンスを組み合わせたPAR-CLIP-sequenceを行った。Zar1は主にｍRNAの3’UTRに結合し、標的RNAには卵子の減数分裂に関わる因子が含まれていることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
mRNAは転写後の翻訳制御の主要な場である。そこでまず、Zar1やZar2がmRNAに結合するかどうか調べた。HAタグ付きのZar1またはZar2をNIH3T3細胞に過剰発現させ、細胞抽出液からオリゴdT磁気ビーズを用いてmRNAに結合する蛋白質を回収し、ウエスタンブロットを行ったところ、Zar1とZar２はmRNA結合していることが分かった。次に、Zar1/Zar2がどのような種類のRNAに結合しているか調べた。Zar1またはZar2を過剰発現させたNIH3T3細胞の抽出液からショ糖密度勾配でmRNPやポリリボソームを分画しZar1とZar2蛋白質をウエスタンブロットで検出した。Zar1とZar2は主に翻訳制御に関わるポリリボソーム分画のｍRNAに結合することが分かった。
さらに、Zar1の標的RNAを同定するために、RNA免疫沈降と次世代シークエンスを組み合わせたPAR-CLIP-sequenceを行った。Zar1の結合部位の約60％はｍRNAの3’UTRに存在し、標的RNAには卵子の減数分裂に関わる因子が含まれていることが分かった。
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| 今後の研究の推進方策 |
標的RNAの安定性試験
Zar1/Zar2をマウス線維芽細胞に過剰発現させ、標的RNAの発現量の増減をRNA sequenceを行って調べる。次に、新たに合成されるRNAをパルスラベルしたのちqRT-PCRを行い、Zar1/Zar2の過剰発現によってRNAの量的変化が起きるのか、起きるとしたらRNAの分解促進によるものなのか、分解抑制によるものなのか調べる。また、RNAのプロセシングが影響を受けていないか、ノーザンブロットで確認する。PAR-CLIP-sequenceの解析結果から得られたZar1/Zar2のRNA認識配列を元に、卵子および受精卵中で発現している遺伝子の中から標的と成り得るRNAを選び出す。卵子を用いてZar1/Zar2のRNA免疫沈降を行い、Zar1/Zar2と結合することを確認する。
Zar1/Zar2とリプログラミングの関係
Zar1/Zar2はリプログラミング因子Lin28と共にマウス受精卵の細胞質にあるP-bodyに存在すると報告されているが、Lin28はポリリボソームやストレス顆粒にも局在しうるので、局在場所を十分に特定出来ているとはいえない。そこでHAタグ付きのZar1/Zar2を線維芽細胞に発現させ、免疫染色して、細胞内のどこにZar1/Zar2が分布するのか、P-bodyやストレス顆粒のマーカーと比較する。また、Zar1はES細胞で発現が認められるので、Zar1をノックダウンして、P-bodyやストレス顆粒のマーカーの局在の変化を調べる。iPS細胞誘導系にZar1/Zar2を加えてiPS細胞誘導効率が上昇するかどうか調べることにより、核のリプログラミングへの関与を探る。
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