| 研究課題/領域番号 |
16K07391
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| 研究機関 | 埼玉大学 |
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研究代表者 |
小竹 敬久 埼玉大学, 理工学研究科, 准教授 (20334146)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 糖ヌクレオチド / シロイヌナズナ / L-アラビノース |
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| 研究実績の概要 |
L-アラビノースは、植物特有の５炭糖（ペントース）の一種であり、かつ植物の主要な糖である。L-アラビノースは糖ヌクレオチドの一種であるUDP-L-アラビノースとして、UDP-キシロースから合成される。この反応は、シロイヌナズナでは、ゴルジ体型のMUR4と細胞質基質型のUGE1とUGE3により触媒される。本年度は、シロイヌナズナやイネに加えて、ゼニゴケやヒメツリガネゴケ等からもMUR4配列とUGE配列を収集し、これらの酵素の起源を探った。配列系統樹では、MUR4と比べて、UDP-L-アラビノース合成活性をもつUGEは比較的期限が新しいことが示唆された（Kotake et al., 2016, J. Plant Res.）。
UDP-L-アラビノース合成活性をもつシロイヌナズナのUGE1（AtUGE1）と、この活性を持たないAtUGE2について、両者の基質特異性の違いを生むアミノ酸残基の特定を進めた。まず、大腸菌で組換えAUGE1と組換えAtUGE2を作成し、これらはUDP-キシロースに対する活性（UDP-L-アラビノース合成活性）が大きく異なることを確かめた。次に、高次構造予測プログラムを利用して、両者の基質特異性に関与するアミノ酸残基の予測と絞り込みを行った。興味深いことに、AUGE1とAtUGE2では基質であるUDP-キシロースと接するアミノ酸残基に違いはないが、基質の通り道に位置するループに違いがあることがわかった。現在、この部位に位置するアミノ酸残基をAUGE1とAtUGE2の間で交換した組換え酵素を作成している。
シロイヌナズナのmur4変異体は、ロゼット葉で最大50％のL-Ara含量の低下を示すが、uge1 uge3二重変異体は目立った形質を示さない。細胞質基質型のUGE1やUGE3の役割を明らかにするために、掛け合わせにより、mur4 uge1 uge3三重変異体を作成した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、（１）AtUGE1とAtUGE2に焦点を当てた基質特異性解析、（２）様々な陸上植物のUGEの基質特異性の解析、（３）シロイヌナズナの多重変異体を用いたUGEの生理的意義の解析、で構成される。本年度は、（１）および（３）は当初の予定通り実施できたが、（２）に遅れが生じた。（２）ではまず、シロイヌナズナに加えて、ヒメツリガネゴケやゼニゴケからUGEの遺伝子を単離し、大腸菌で組換えUGEを作成する予定であったが、ヒメツリガネゴケやゼニゴケで一部のUGEのcDNAをRT-PCRで増幅できなかった。次年度は、目的UGEが高発現するエイジや部位の植物試料を準備し、RNAの調製方法を改善することで、この問題を解決する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞質基質型UDP-L-アラビノース合成酵素UGE1やUGE3は、真核生物で高度に保存されたUDP-グルコース4-エピメラーゼから生じた変異型酵素と考えられる。シロイヌナズナでは、UDP-L-アラビノース合成を獲得する前のUGEとして、UGE2, 4, 5（以下、UGE2型）が、獲得したUGEとしてUGE1,3（以下、UGE1型）が存在する。そこで、UGE1型とUGE2型で異なるアミノ酸残基が保存された部位を交換した組換え酵素を作成し、両者の基質特異性を比較する。基質の通り道に位置するループによく保存された違いがあるため、このループに含まれるアミノ酸残基を標的とする予定である。すでに、このような変異UGEを発現するための発現ベクターを準備し、組換え酵素作成を進めている。次年度は、基質特異性は、UDP-グルコース4-エピメラーゼ活性（UDP-グルコースとUDP-ガラクトースの間の変換）とUDP-キシロース4-エピメラーゼ活性（UDP-キシロースとUDP-L-アラビノースの間の変換）を調べる予定である。
UGEの機能分化は、被子植物や裸子植物ではみられるが、これら以前の植物では不明である。そこで、ヒメツリガネゴケとゼニゴケからUGE遺伝子を単離し、これらの植物に、UDP-キシロース4-エピメラーゼ活性をもつUGEが存在するか、を調べる。
被子植物や裸子植物が細胞質基質経路を獲得した生理的意義を探るべく、mur4 uge1 uge3三重変異体を解析する。先行的に５週齢のシロイヌナズナでL-Ara含量を調べたが、mur4 uge1 uge3三重変異体はmur4変異体とL-Ara含量にあまり違いがなかった。UGE1やUGE3は、限られたエイジや部位でUDP-L-アラビノース合成に貢献していると考えられる。そこで、次年度は、これらの変異体をエイジ別、部位別で比較する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ヒメツリガネゴケやゼニゴケからの遺伝子単離が遅れたため、これに続いて行う予定だった発現ベクター作りも実施できなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
適切な植物試料を準備するとともに、RT-PCRの条件を改善し、cDNAを単離する。また、発現ベクターpET15bを用いて、組換えタンパク質調製のためのプラスミドを作成する。繰越す165,701円はこれらの実験に使用する。
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