| 研究課題/領域番号 |
16K07395
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| 研究機関 | 静岡大学 |
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研究代表者 |
本橋 令子 静岡大学, 農学部, 教授 (90332296)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 葉緑体 / 病害応答 / 虫害応答 / 葉緑体タンパク質破壊株 |
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| 研究実績の概要 |
葉緑体の機能として光合成、脂肪酸合成、アミノ酸合成、亜硝酸還元などが知られている。さらに近年では、葉緑体は病原菌の感染による免疫応答に関わるCa2+シグナル伝達やROS（reactive oxygen species）を発生する場としての機能を持ち、病害応答において病原菌の侵入を認識するシグナルを受けることで免疫応答を誘導することがわかり始めている。そこで、植物の防御応答メカニズムであるPTI（pattern-triggered immunity / PAMP-triggered immunity）を引き起こす、Pseudomonas aeruginosaの鞭毛を構成するフラジェリンのN末端にある22個のアミノ酸配列（flg22）を用いて、葉緑体の機能と病害応答の関係を解明するため、葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株のスクリーニングを行った。シロイヌナズナの葉緑体には、3500以上の葉緑体タンパク質が存在していることが示されている。我々は葉緑体への局在が予測された2090の葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株をバイオリソースセンターより集め、約2000ラインの葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株を収集した。収集した遺伝子破壊株を培地に無菌播種し、５日後の実生に１μM flg22処理し、野生型より生育阻害を受ける感受性株、または、野生型より生育阻害を受けない非感受性株を選抜した。その後、2μM flg22処理し、表現型の再現性を確認した。
病害応答に関与する葉緑体タンパク質の解明と同様に、虫害応答に関与する葉緑体タンパク質を探索するために、葉緑体タンパク質遺伝子破壊株について、ハモグリバエの加害の程度を指標にスクリーニングを行う準備を始めた。まず、老化に関与する葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株を用いて、野生型とハモグリバエの加害の程度を比較する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
フラジェリンのN末端にある22個のアミノ酸配列（flg22）を用いて、葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株1284ラインのスクリーニングを行った。2次スクリーニングによって表現型の再現性が得られたラインは16ラインであった。表現型の再現性が得られた16のタグライン（葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株）のアレルを探索し、アレルでの表現型の再現性の確認を行った結果、確認できたものは3ラインであった。３ラインのそれぞれの原因遺伝子はAt1g60590（Pectin lyase-like superfamily protein）, At3g63510（FMN-linked oxidoreductase superfamily protein）とAt1g78815（Light sensitive hypocotyls 7）であった。この３ラインのうちflg22非感受性変異体は、At1g60590の遺伝子破壊株であり、他の２ラインAt3g63510とAt1g78815の遺伝子破壊株はflg22感受性変異体であった。上記の３つの遺伝子破壊株の遺伝子発現をRT-PCRを用いて調べた結果、いずれの遺伝子破壊株も転写産物は検出されず、完全な遺伝子破壊株であった。
葉緑体タンパク質と虫害応答の解明のために、葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株のハモグリバエの加害の程度を指標にスクリーニングを行う準備を始めた。共同研究者の安部らにより、古い葉のみがハモグリバエにより加害されることが報告されたので、まず、老化に関与する葉緑体タンパク質の遺伝子破壊株を用いて、野生型とハモグリバエの加害の程度比較する。 老化に関与するSAG2,SEN1の遺伝子破壊株、虫に食われたような模様に見える斑入り変異体や黄緑変異体、stay green 変異体などを準備したが、担当者の休学により実験は進んでいない。
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| 今後の研究の推進方策 |
flg22処理のスクリーニングによって得られた３つの病害応答に関与する葉緑体タンパク質の機能解析を行う。１）各原因タンパク質について、GFP融合タンパク質を作るコンストラクトを作成し、パーティクルガンによりタバコ、又はシロイヌナズナの葉に導入し、細胞内局在を確認する。２）各タンパク質のflg22誘導性、ストレス誘導性、組織特異的発現など、遺伝子発現解析を行う。３）各変異体について、flg22ペプチドを認識するレセプターFLS2、シグナル伝達経路遺伝子、ROSに関係する遺伝子、サリチル酸生合成遺伝子ICS1(isochorismate synthase1)などの発現解析を行う。４）２）、３）の発現解析の結果、病害応答と各葉緑体タンパク質の関係が明らかにならなかった場合は、シロイヌナズナのオリゴDNAマイクロアレイを用いてトランスクリプトーム解析を行う。得られたトランスクリプトーム解析データと既存のflg22処理トランスクリプトームデータの比較を行う。
ハモグリバエを用いた加害による、虫害に関与する葉緑体タンパク質のスクリーニングについては、収集した老化に関与するSAG2,SEN1の遺伝子破壊株、斑入り変異体や黄緑変異体、stay green 変異体を用いて行う。
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