| 研究課題/領域番号 |
16K07399
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
山野 隆志 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (70570167)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 重炭酸イオン輸送体 / CO2シグナル伝達 / Ca2+シグナル伝達 / クラミドモナス / CO2濃縮機構 / ピレノイド |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、我々が同定した2種類の膜タンパク質HLA3とLCIAによる協調的な重炭酸イオン輸送が、カルシウムイオン（Ca2+）とCO2シグナル伝達のクロストークによってどのように制御されるのかを明らかにすることを目的とする。具体的には、緑藻クラミドモナスにおいてCO2濃縮機構（CCM）の制御に重要であることが本研究課題で明らかにりつつあるCa2+結合タンパク質CASの機能解析を中心に進める。
今年度は以下のことを明らかにした。(1) CASのC末端にタグを付与するとCASタンパク質が不安定化し分解される問題があり、in vivoにおけるCASの細胞内局在観察に問題が生じていた。しかし、改変型GFPであるCloverの導入、CASとCloverの間へのフレキシブルリンカー配列の挿入、発現株の繰り返しの作出と凍結保存などの数多くの試行錯誤を通して、CASの高解像度における葉緑体内局在観察に初めて成功した。CASはCCMが誘導されない高CO2条件では葉緑体のチラコイド膜に沿って分散しているが、低CO2条件に移して2時間後にはピレノイドチューブ（葉緑体内のサブオルガネラであるピレノイドに貫入しているチラコイド膜）に沿って車輪状に局在し、12時間後にはピレノイド内部に凝縮して局在することが分かった。(2) Ca2+特異的阻害剤BAPTAの添加により、CO2応答性を示すCCM関連遺伝子の発現パターンが変化することを明らかにした。(3) DNAタグのランダム挿入によるCCM機能不全株の大規模スクリーニングを行い、新規なCCM調節変異株の候補を複数単離した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度に報告したCCMの新規調節因子CASの細胞内局在変化を高解像度で明らかにし、論文が受理された（Yamano et al. Protoplasma in press）。またCCM1やCASの下流因子あるいは葉緑体から核へのレトログレードシグナルに関わる因子を同定できる可能性のある、複数のCCM調節変異株を単離することができた。一方で、CAS-Clover発現株においても長期の保存中にはCASが分解することが分かり、不安定性の原因は不明のままである。そのため、当初の予定であったCAS-Cloverの局在異常変異株の探索は中止し、LCIB-Cloverの局在異常変異株の解析を行うことに方針を変更した。LCIBはCASと同様に葉緑体内で局在を変化させるCO2濃縮因子であり、CASの代わりに使用できると判断した。以上の理由から、研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は以下の研究方針に従って進める。（1）CASはCa2+結合領域の他に疎水性領域とRhodanese-likeドメインを持つがその機能は明らかでない。それぞれのドメインを削ったCASタンパク質を変異株で発現させ、その局在や表現型を観察する。（2）光とCO2に応答したLCIBの局在変化に関わる因子を同定するために、LCIB-Clover発現株にDNAタグをランダムに導入し、その局在が異常になった変異株をスクリーニングする。これを1株ずつ観察し、原因遺伝子を同定する。（3）CO2欠乏条件におけるCAS複合体を精製し、相互作用タンパク質を同定する。（4）活性酸素、酸化還元電位、テトラピロール中間体（Mg-ProtoIX）などがCCMの制御において葉緑体から核へのレトログレードシグナルに働いている可能性を考え、活性酸素処理、活性酸素消去処剤、種々のテトラピロール添加、Mg-ProtoIX合成阻害剤などの添加による表現型を調べる。(5) Ca2+特異的阻害剤BAPTAの添加により、CO2応答性を示すCCM関連遺伝子の発現パターンが変化することを明らかになったので、これを論文としてまとめる。(6) DNAタグのランダム挿入によって得られた新規なCCM調節変異株の候補について、表現型の解析と原因遺伝子の同定を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）
当初想定していたCAS-Clover発現株を用いた局在異常変異株の実験について、CAS-Cloverの不安定性により実験を中止せざるを得なく、物品費の支出に変更が生じたため。
（使用計画）
CAS-Cloverの代わりにLCIB-Cloverを利用することで同様の実験が可能となることが分かったので、来年度の物品費に補填する。
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