| 研究課題/領域番号 |
16K07411
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| 研究機関 | 基礎生物学研究所 |
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研究代表者 |
真野 弘明 基礎生物学研究所, 生物進化研究部門, 特別協力研究員 (80376558)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | オジギソウ / 運動 / カルシウム / イメージング / CRISPR/Cas9 / トランスジェニック / 自動化 / ラズベリーパイ |
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| 研究実績の概要 |
研究実施計画に基づき、本年度はオジギソウの運動におけるカルシウム動態のイメージング解析、およびその延長線上の実験として新たな遺伝子改変オジギソウの作出を行った。すでに樹立済みのGCaMP6fカルシウムセンサー発現ラインに関しては、埼玉大学の豊田博士との共同研究により詳細な解析を進め、現在も継続中である。また、生体内のカルシウム濃度を人為的に上昇させる実験を行うために、光依存的にカルシウムイオンを放出するPACRタンパク質を導入したトランスジェニックオジギソウを作出した。これらと並行して、おじぎ運動の遺伝子レベルでの解析を行うために、オジギソウ遺伝子のノックアウト個体作出を行った。以前に行ったRNA-seq解析により、葉枕の収縮側に特異的に発現する遺伝子として機械刺激受容チャネル等、運動への関与が予想されるいくつかの遺伝子候補が同定されていた。本研究では、これらの遺伝子をCRISPR/Cas9システムを用いて植物体内で変異させると同時に、CRISPR/Cas9用の発現ベクター上にGCaMP6f発現カセットを搭載することにより、遺伝子変異個体が得られた際に同じ個体でシームレスにカルシウム動態のイメージングが行えるような実験系を構築した。15の候補遺伝子に関して上述のベクターを用いたトランスジェニック個体の作出を試み、そのうち12の遺伝子に関して正常遺伝子を欠失した個体を得ることができた。さらに、遺伝子欠失の運動への影響をマクロレベルで定量的に解析するために、小型コンピューターであるラズベリーパイを用い、簡単なロボットを用いた機械刺激からビデオ撮影までを全自動で行うマクロ運動解析システムの開発を行った。現在、試作システムの開発が終了し、目標とする解析に対して十分な精度とパフォーマンスを示すことが確認できた。現在、さらなる精度向上を目指して同システムの改良を行っている最中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度の研究は、研究計画調書に記載の研究目的に沿って遂行された。カルシウム動態のイメージングに関しては、研究計画調書の作成時点では野生型をベースにしたトランスジェニック個体のみを解析対象としていたが、その後の研究進展によりおじぎ運動とカルシウム動態に関与すると期待されるいくつかの遺伝子候補が新たに同定された。このため、これらの遺伝子欠失個体におけるイメージングも併せて計画し、本年度中にその作出に成功した。また本研究計画では当初、顕微鏡を用いたミクロレベルでのイメージングのみを計画していたが、その過程において研究代表者自らが身に着けたプログラミング技術を応用し、ロボットによるオジギソウ刺激の自動化やそれに同期した動画の自動取得等、マクロレベルでのイメージング解析に関しても新たに遂行が可能になった。以上のように、本研究では当初計画をもとにしつつ、新しい着想や技術発展に伴う改善が日々加えられており、おおむね順調に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の研究成果により樹立した遺伝子欠失オジギソウに関して、本年度開発のマクロ運動解析システムを利用し、当該遺伝子の欠失が運動性能に与える影響を定量的に解析する。運動に顕著な影響が認められた個体に関しては、カルシウムセンサータンパク質を利用した蛍光イメージングを行い、遺伝子欠失がカルシウム動態に与える影響を解析する。さらに、コントロール個体との間でアクチン細胞骨格の形態比較を組織学的手法を用いて行い、差異を検証する。以上の解析結果をもとに、当該遺伝子が分子動態およびおじぎ運動において果たす役割を推測し、その成果を論文としてまとめ発表を行う。また、昨年度から継続して行っている葉枕の細胞形態の3Dイメージングに関しても、自動解析プログラムのさらなる改良と発展に注力し、その成果を論文としてまとめ発表を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額の金額の大半は前年度から持ち越し分に由来するものであり、本年度請求分に関してはほぼ当初の計画通りに使用することができた。前年度からの持ち越し分に関しては当初、実験規模のスケールアップに伴う作業量の増大を予想し、これに対応するために実験補助員を雇用する目的に充てることを考えていた。しかし、研究代表者自らの手による実験手法の合理化や、おじぎ運動の解析のための自動化システムの開発などにより、これらに関わる作業労力を大幅に減らすことに成功し、その結果として実験補助員の雇用を本年度は必要としなかった。また、自動化システムの開発においても、非常に安価なコンピューターであるラズベリーパイを利用して研究代表者自らが全ての装置を組み上げたことにより、金銭的な支出が大幅に削減され、結果として予算の使用を最低限に抑えることができた。
次年度の予算使用計画としては、まず本年度の研究成果により多数の遺伝子欠失オジギソウが作出されたため、その安定的な維持のために世話を行う実験補助員の雇用が必要不可欠と考えられる。また次年度には得られた成果についての論文投稿に関する費用が必要になる。昨年度および本年度請求分から持ち越された分に関しては、これらの目的に研究費を使用する予定である。翌年度請求分の研究費に関しては、研究計画調書に記載の次年度以降の研究計画に基づいて使用する予定である。
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