| 研究課題/領域番号 |
16K07417
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| 研究機関 | 東京学芸大学 |
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研究代表者 |
三田 雅敏 東京学芸大学, 教育学部, 教授 (50190674)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 生殖腺刺激ホルモン / 比較内分泌 / リラキシン様ペプチド / G-タンパク受容体 / 生殖生物学 / ヒトデ |
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| 研究実績の概要 |
無脊椎動物の生殖制御機構を分子レベルで解明することを目的として、本研究では、ヒトデの生殖腺刺激ホルモン (relaxin-like gonad-stimulating peptide, RGP)に注目し、(1) RGPの輸送経路、および (2) RGP受容体について解析をおこなった。
(1) RGPの輸送経路： イトマキヒトデRGP (PpeRGP)の抗体作成に当たり、PpeRGPのスルファニル-ポリエチレングリコール(PEG)誘導体を化学合成した。スルファニルPEG-PpeRGPにKLHを結合させ抗原とし、ウサギに免疫することで、ポリクローナル抗体を作成した。得られた抗体はPpeRGPに対して高い特異性と力価を示した。イトマキヒトデの放射神経に対して、PpeRGP抗体による免疫染色を施したところ、管足側周辺部にポジティブなシグナルが得られた。このことから、PpeRGPは放射神経の管足側周辺部に分布していることが示唆された。さらにPpeRGP抗体を用いてラジオイムノアッセイ法によるPpeRGPの定量法を開発した。
(2) RGP受容体： イトマキヒトデ卵濾胞細胞からリラキシンファミリーペプチド受容体(RXFP)と相同性の高いcDNAをクローニングした。Coding DNAシーケンスは2841 bpから成り、947個のアミノ酸をコードしていた。タンパク質に翻訳した配列にはG-タンパク共役型受容体にみられる7箇所の膜貫通領域が存在し、さらにシグナルペプチドと5箇所のロイシンリッチリピート配列を持つことが確認できた。以上の結果から、今回得られたcDNAはPpeRGPの受容体をコードしている可能性が極めて高い。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
(1) RGPの輸送経路：研究計画通り、イトマキヒトデの生殖腺刺激ホルモン(PpeRGP)の抗体を作成することができた。それにより放射神経におけるRGPの分布状況が明らかになったばかりでなく、PpeRGPのラジオイムノアッセイ(RIA)系を確立することができた。
(2) RGP受容体：RGPの受容体候補として、イトマキヒトデ卵濾胞細胞から新規にRXFPと高いホモログを持つcDNAがクローニングされた。すなわちPpeRGP受容体である可能性が極めて高い。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) RGPの輸送経路：計画通り、PpeRGP抗体を使ってイトマキヒトデの放射神経や周口神経を免疫染色をおこないRGPの分布について解析する。また、RIA系に加え、新たにELISA法によるPpeRGPの定量方法を確立する。
(2) RGP受容体：今回リラキシン受容体のホモログとして得られたcDNAがPpeRGP受容体であることを証明する。具体的には、得られたcDNAをCOS-7培養系細胞で強制発現させ、RGPとの結合実験やPpeRGPを処理した際に細胞内サイクリックAMP濃度に変動があるかどうかを確認する。
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