| 研究課題/領域番号 |
16K07435
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
阿部 秀樹 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (90396804)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 神経修飾ペプチド / 開口放出 / トランスジェニックメダカ / イメージング |
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| 研究実績の概要 |
魚類終神経GnRH3ペプチド神経系をモデルとして、ペプチドニューロンによる感覚情報処理に対する神経修飾機構について、“ペプチドニューロンはその活動に応じて何時何処からペプチドを放出するのか？”、また、“放出されたペプチドはどのように感覚や行動を司る神経回路を修飾するのか？”、を明らかにすることを目的として研究を進めている。
そのために、以下の研究を展開した。
①代表者が開発したキンギョ終神経GnRH3ニューロンー嗅球ニューロン共培養系を用いて、脱分極刺激によって誘起された、ペプチド放出に先だって生じる単一終神経GnRH3ニューロン局所の細胞内Ca2+濃度上昇をCa2+イメージング法によって測定し、細胞体と神経突起において寄与する電位依存性Ca2+チャネルの構成が異なることを示唆する結果を得た。
②GnRH3ニューロン特異的に開口放出センサータンパク質（分泌小胞内に発現するようにデザインされたpH感受性GFP）を発現するトランスジェニックメダカを作出し、メダカ胚・稚魚脳において終神経における開口放出センサータンパク質の蛍光発現を確認すると共に、それらの個体から取り出して分散培養した蛍光放出センサータンパク質を発現するGnRH3ニューロンで脱分極刺激によって細胞体および神経突起の両者における一過性蛍光強度増大を計測した。
③終神経GnRH3ニューロンからの神経線維が密に投射する中枢視覚経路における神経回路修飾機構を明らかにすることを目的として、メダカ単一視蓋ニューロンの視覚刺激に対する応答記録系を作製し、局所運動刺激・運動方向選択性に関する受容野構造を解析した。また視覚情報が引き金となって生じる単純な行動を指標としたメダカ視覚行動アッセイ系と脳内への神経ペプチド急性投与方法を検討した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は下記の成果を得た。特に②のGnRH3ニューロン特異的に開口放出センサータンパク質を蛍光イメージングが実施可能なレベルで発現するトランスジェニックメダカが作製できたことから順調に研究が進んでいると考えている。
①キンギョ培養終神経GnRH3ニューロンにおける脱分極刺激による細胞内Ca2+濃度変動をイメージングにより計測し、電位依存性Ca2+チャネル阻害薬投与が局所Ca2+濃度変化に及ぼす影響を解析した。その結果、細胞体と神経突起それぞれで脱分極刺激に依存した細胞内Ca2+濃度上昇に寄与する電位依存性Ca2+チャネルの構成が異なることが示唆された。
②GnRH3ニューロン特異的に開口放出センサータンパク質（分泌小胞内に発現するようにデザインされたpH感受性GFP）を発現するトランスジェニックメダカを作出し、DNAコンストラクトを注入した世代から2世代経過したメダカ胚・稚魚脳において終神経における開口放出センサータンパク質の蛍光発現を確認した。そこでこれらの個体から脳を取り出し、開口放出センサータンパク質を発現するGnRH3ニューロンの分散培養を作製し、in vitroイメージングを行った。その結果、脱分極刺激によって単一GnRH3ニューロン細胞体および神経突起の両者における一過性蛍光強度増大を計測することができた。
③メダカを材料として視覚情報処理経路に対して終神経から放出されるGnRH3ペプチドの神経修飾作用を解析するため、(i)単一視蓋ニューロンの局所視野運動に対する応答特性・受容野構造をin vivo電気活動記録により解析した。(ii)また視覚情報が引き金となって生じる単純な行動を指標としたメダカ視覚行動アッセイ系を検討すると共に、今後GnRHペプチドによる神経修飾作用を個体レベルで解析する準備として、麻酔したメダカ脳内への神経ペプチド急性投与方法を検討した。
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| 今後の研究の推進方策 |
キンギョ培養終神経GnRH3ニューロンを用いた研究では、計画通り観察された局所Ca2+濃度上昇と開口放出との結びつきについて解析を進めると共に、頻繁に開口放出が生じる部位における細胞骨格形成・解離とその制御についてイメージング解析を進める。
GnRH3ニューロン特異的に開口放出センサータンパク質を発現するトランスジェニックメダカについては、同トランスジェニックメダカを系統として確立することをまず最優先で進める。そして同系統を使って作製した培養GnRH3ニューロンをキンギョ培養GnRH3ニューロンと併用して、単一ペプチドニューロンにおける局所開口放出制御機構の解析に用いると共に、GnRH3ニューロンが投射する嗅球や視蓋におけるペプチド開口放出のin vivoイメージングを基礎生物学研究所の共同利用機器（光シート顕微鏡や二光子顕微鏡）を使用して進める。
GnRHペプチドが視覚情報処理機構に及ぼす神経修飾作用の解析については、単一視蓋ニューロンからの神経活動のin vivo記録が多分に熟練を要するため、電気生理学的研究と平行して、測定に高度な熟練を要しない行動実験を併用することで進めていくことを計画している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
トランスジェニックメダカの作出に時間がかかり、28年度は系統樹立後の機能解析のために必要な機器を購入する必要がなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
研究が進展した結果、交付申請書で記入したマイクロスライサーを使わずとも稚魚脳や胚を用いてイメージングが十分可能なことが明らかになりつつある。このため前年度使用しなかった物品費は機器の購入ではなく、新たな系統作成の為の分子生物学実験の試薬代や生理学実験で使用する阻害薬や蛍光試薬、マニピュレータなどの購入に充てることを計画している。
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