| 研究課題/領域番号 |
16K07467
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| 研究機関 | 秋田県立大学 |
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研究代表者 |
鈴木 英治 秋田県立大学, 生物資源科学部, 教授 (60211984)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 光合成 / 貯蔵多糖 / 澱粉 / 進化 / シアノバクテリア / グリコーゲン / ゲノム編集 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の課題名は「光合成原核生物シアノバクテリアにおける植物型多糖生産の機構解明」である。ほとんどのシアノバクテリア（ラン藻）種が、原始的な可溶性多糖であるグリコーゲンを産生するのに対し、Cyanothece、Cyanobacterium 属など一部の種では、植物の澱粉成分であるアミロペクチンと類似した結晶性を示す高機能性多糖を蓄積する。本研究では、貯蔵多糖蓄積の生理的意義を解析し、異なるタイプの多糖を生産することによる生理特性の違いを調べるとともに、澱粉生産種（非モデル種）においては未だ報告例のない遺伝子改変技術の確立を目指す。
生理学研究に汎用される 3 種のモデル株（いずれもグリコーゲン産生型）およびその変異株、Synechococcus elongatus PCC 7942（野生株、ADP-グルコースピロホスフォリラーゼ、グリコーゲン合成酵素各変異株）、Synechocystis sp. PCC 6803 株、Anabaena sp. PCC 7120 株を用い、15℃、30℃ および 40℃ 条件での液体培養を行い、生育速度ならびにグリコーゲン産生量を比較した。各野生株では 30℃ 条件と比較して、いずれも 15℃ におけるグリコーゲン生産が促進された。グリコーゲン合成能を欠損した変異株では、低温、および高温での生育が著しく阻害された。
Streptococcus pyogenes 由来 Cas9 遺伝子を含むプラスミド pwtCas9-bacteria を入手し、Cas9 遺伝子をシャトルプラスミドに連結して S. elongatus PCC 7942 に導入した。併せて同株および Cyanobacterium aponinum PCC 10605 の ADP-グルコースピロホスフォリラーゼ遺伝子破壊用の sgRNA コンストラクトを作製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
貯蔵多糖（グリコーゲン、澱粉）は代表的な光合成産物の一つであるが、これらを蓄積することの生理的意義に関しては意外にも研究事例は少ない。本研究初年度において異なる温度でのシアノバクテリアの生育特性を解析し、低温および高温ストレスにおいて貯蔵多糖蓄積が必須であるという明らしい知見を得た。今後、グリコーゲン合成能欠損株の低温耐性を精密に解析し、論文発表につなげたい。
澱粉生産性シアノバクテリア種では遺伝子改変技術が確立しておらず、研究進展が阻まれてきた。これは澱粉生産種において相同的組換えがほとんど認められないことに起因している。本研究では近年発展しつつあるゲノム編集技術を適用し、多糖代謝遺伝子への変異導入を試みるとともに、得られた変異株の特性解析を行う計画である。平成28年度は澱粉生産株 Cyanobacterium aponinum PCC 10605 の ADP-グルコースピロホスフォリラーゼ（AGPase）遺伝子断片をクローン化し合成オリゴヌクレオチドと組み合わせて sgRNA コンストラクトを作製した。並行して S. elongatus PCC 7942 由来 AGPase 遺伝子の sgRNA コンストラクトを調製するとともに、Cas9 遺伝子のクローン化と形質転換を行った。後者の PCC 7942 株は遺伝子操作が容易なモデル株であり、ゲノム編集技術適用時に発生しうる問題の早期発見と対処に資するものと見込まれる。
以上の状況から、各研究項目は順調に進展していると判断される。
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| 今後の研究の推進方策 |
温度ストレス（高温、低温）環境下における貯蔵多糖代謝に関して、澱粉生産株である C. aponinum PCC 10605、Cyanothece sp. PCC 8802 株を用い、高温（40℃）および低温（15℃）における生育と貯蔵多糖生産を調べる。グリコーゲン生産種である3株 (S. elongatus PCC 7942、Synechocystis sp. PCC 6803、Anabaena sp. PCC 7120株) について前年度得られた結果と比較し、共通性、特異性の有無を検証する。
ゲノム編集技術の開発については、S. elongatus PCC 7942 での Cas9 および AGPase-sgRNA の共発現のためのコンストラクト作製、および形質転換を行う。sgRNA は 100 塩基対程度と短く、従来の制限酵素法によるクローン化に困難を伴うため、In-Fusion 法を利用して行う。C. aponinum PCC 10605 についても同様のコンストラクト構築を進める。ただし、同株を含め一般のシアノバクテリアでは独自のクローニングベクター系がなく、自然形質転換法や相同的組換えも適用できないことが見込まれる。そこで広域宿主ベクターを用い、形質転換については大腸菌を用いた接合法やエレクトロポレーション法による遺伝子導入を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究においては、シアノバクテリアの貯蔵多糖代謝（合成代謝）に関与する遺伝子を特異的に破壊し、その影響を検証することを目的としている。遺伝子変異を確認する方法として、抗体を用いた酵素タンパク質の検出が強力な手法となる。シアノバクテリアのグリコーゲン合成酵素（GS）は植物の澱粉合成酵素（SS）と配列類似性を示すため、イネ SS（I 型アイソザイム）に対する抗血清により GS タンパク質が検出できるかを調べた。しかしながら、免疫交差反応を確認できなかったため、GS 特異的な抗体の調製が必要であると考えられた。GS タンパク質表面に露出していると考えられるペプチドを合成した後、これらを用いて抗血清を作製中である。必要経費の支払い手続きが年度をまたいだため、平成29年度の支出となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
前項に記載の通り、本研究の目的達成のためシアノバクテリア GS に対する抗血清を作製中である。抗血清が調製され次第、支払い手続きに入るため、助成金は遅滞なく使用される計画である。
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