| 研究課題/領域番号 |
16K07557
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
門田 有希 岡山大学, 環境生命科学研究科, 准教授 (30646089)
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| 研究分担者 |
田淵 宏朗 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 九州沖縄農業研究センター, 上級研究員 (10355571)
牛島 幸一郎 岡山大学, 環境生命科学研究科, 准教授 (20379720)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | サツマイモ / RNA-seq / Iso-Seq / 線虫 / 発現解析 / 非モデル作物 / 完全長cDNA |
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| 研究実績の概要 |
今年度は、前年度得られたロングリードを対象とした解析とさらにショートリードを用いたRNA-seqを行った。RNA-seqについてはサツマイモネコブセンチュウ抵抗性品種であるジェイレッドと感受性品種である潮州を供試した。コントロール区、線虫接種24時間後および6日後の根をサンプリングし、Total RNAを抽出した後KAPA mRNA HyperPrep KitによりIllumina RNA-seq用のライブラリを作製した。イルミナ社HiSeq4000によるシーケンスを行い、アダプターや低品質配列の除去などの前処理を行った結果、545,875,492の高品質なリードを得た。サツマイモと同属であるアサガオ（Ipomoeae nil）のmRNA配列を対象にBowtie2によるアライメントを行い、eXpressやedgeRなどを用いて発現変動遺伝子（DEG）を検出した。その結果、品種間差よりも線虫接種により遺伝子の発現がダイナミックに変動することが示唆された。またGO解析を行った結果、両品種において線虫接種に伴い細胞死やストレス応答性に関する遺伝子の発現が上昇していることが示された。特に抵抗性品種であるジェイレッドにおいて細胞死に関する遺伝子の発現がより上昇していた。
一方、Iso-Seq解析についてはPacBio RSIIによるシーケンスを行った結果、1,296,320のコンセンサス配列(平均長; 2,791 bp)を得た。SMRT Link 4.0を用いた解析により合計54,492の高精度なアイソフォーム配列を得た後、CD-HIT-ESTを用いて冗長配列をクラスタリングしたところ、37,488のアイソフォーム配列を得た。さらにBlas2GOによる機能アノテーションを行ったところ、31,696(84.5%)個がアノテーションされた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度RNA-seqに関する実験、解析も一通り終えることができた。よって研究は順調に進展していると思われる。根組織からのサンプリングに予定より少し時間がかかったが、核酸抽出や、サンプル調製も順調に進み、質の高いライブラリも作成できた。そのため、HiSeq4000によるシーケンスにも問題はなかったと思われる。しかし、いくつか改善すべき点はあると思われる。例えばRNA-seqリードのアライメントにアサガオ（Ipomoea nil）のmRNA配列を参照配列として用いたが、平均アライメント率は60%と低く、４割のリードを使えていない。また、昨年Jun et al., (2017)によって、サツマイモHaploidのゲノム情報や遺伝子情報も公開されたため、そちらの情報も活用し研究を進めて行く必要があると思われた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は一先ずRNA-seqに関する解析を終えることができたが、解析ツールの詳細な検討は出来ていない。そこで今後は複数の解析ツールを使用し、アライメント結果や発現変動遺伝子数等を比較することで最適な解析ツールを選定する。また、Jun et al., (2017)によりサツマイモの遺伝子情報の一部が公開されたため、その情報も活用し、サツマイモにおける高精度な遺伝子情報を構築したいと考えている。こちらは当方で行ったIso-Seqの結果と統合することで、可能な限りゲノム全体を網羅した遺伝子セットを構築、公開する予定である。この遺伝子セットにRNA-seqのリードをアライメントし、できるだけ取りこぼしの無い条件で解析を行い、発現変動遺伝子を同定する。それにより線虫接種に伴い発現が変動する遺伝子を同定、線虫抵抗性反応に関する知見を得る予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
シーケンスコストが当初予定していたよりもかからなかったため、次年度使用額が生じた。RNA-seq用の試薬代金等に使用する予定である。
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