| 研究課題/領域番号 |
16K07581
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
福田 あかり 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 中央農業研究センター 作物開発研究領域, 主任研究員 (40355235)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 植物 / 生理学 / ストレス / トランスクリプトーム / イネ |
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| 研究実績の概要 |
大型の穂を持ち、多収のインド型稲は、加工米や飼料用米などの新規需要米の育種材料として用いられている。しかし、熱帯地方を起源とするインド型稲は、日本型稲に比べ生育初期の低温耐性が低く、低温により葉が黄化する低温クロロシスと呼ばれる傷害や、苗の生育不良などの問題が起こっている。稲の低温耐性を高めるため、低温耐性の生理メカニズムの解明、耐性に関わる遺伝子の同定が求められており、研究代表者は、これまで低温耐性の高い日本型稲と、耐性の低いインド型稲の交配後代系統を用いて遺伝子型（DNA型）の調査を行い、低温耐性に関連する遺伝子座を検出するQTL解析を行ってきた（Fukuda et al., 2015. Plant Prod. Sci. 18: 128-136.）。しかし、検出された低温耐性遺伝子座はいずれも作用力が小さく、低温耐性には、そうした作用力の小さい多数の遺伝子座が関わることが明らかとなった。作用力の小さい複数の遺伝子座を同定することは困難であり、従来のQTL解析では、低温耐性メカニズムの全容解明は進めづらいものとなっている。本研究では、QTL解析に代わる方法として、形質に直接作用する転写産物（RNA）を網羅的に調査する、トランスクリプトーム解析を行う。これにより、低温耐性をもたらす転写産物を同定し、稲苗の低温耐性の生理メカニズムの解明を目指す。平成28年度は、インド型稲と日本型稲の交配後代系統の中から、低温耐性の高い系統と低い系統を選抜し、次世代シーケンサーを用いてのトランスクリプトーム解析（RNA-seq解析）を行った。網羅的に検出した転写産物の中から、低温条件下で、低温耐性の高い系統で特徴的に発現する転写産物の選出を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成28年度は、低温耐性の低いインド型稲品種ハバタキと、低温耐性の高い日本型稲品種Arroz da Terraの交配F2世代1124個体について、苗を低温下で生育させ、第3葉の葉緑素濃度（SPAD値）を指標に、低温耐性の検定を行った。葉緑素濃度の上位51個体、下位51個体それぞれを選抜して低温耐性系統、感受性系統とし、第3葉のRNAを抽出した。さらに、系統を25℃の高温下に移動して栽培し、2週後の第5葉葉緑素濃度を測定し、RNAを抽出した。ハバタキ、Arroz da Terra、低温耐性上位系統バルク、下位系統バルクそれぞれについて、低温下、高温下での葉の転写産物発現量解析を、次世代シーケンサーを用いてのRNA網羅解析(RNA-seq解析)により行った（クロックミクス社委託解析）。網羅的に検出された転写産物の中から、低温条件下において、低温耐性系統と感受性系統間での発現量に差のある転写産物の選出を行った。さらに、選出された転写産物の中から、親品種のハバタキとArroz da Terra間においても、低温条件下での発現量に差のある共通の転写産物を選出した。結果、選出された候補転写産物の中に、ストレス反応・シグナル伝達に関わると予想される遺伝子が含まれていた。
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| 今後の研究の推進方策 |
・選出した低温耐性候補転写産物について、定量的RT-PCRを用いての発現量の調査を行う。転写産物のシークエンス配列をもとに定量的RT-PCRのためのプライマーを設計し、増幅反応条件の検討を行う。定量的RT-PCRの条件が確立した後は、ハバタキ、Arroz da Terraおよび交配系統について、低温条件下、温暖条件下での発現量の調査を行う。また、転写産物の発現量と、低温耐性程度（葉緑素濃度）との比較を行う。Arroz da Terra、ハバタキ交配系統において発現量と低温耐性との相関の見られた転写産物については、他品種においても定量的RT-PCRによる発現量調査を行い、転写産物が他品種でも低温耐性程度と関連を持つか調査する。
・低温耐性候補転写産物について、系統間の塩基配列の変異を調査し、発現量の違いが塩基配列の変異によるものか、それ以外の発現誘導量、ｍRNAの編集等によるものかを明らかにする。
・転写産物網羅解析に用いたハバタキ/Arroz da Terra交配系統について、低温耐性系統、感受性系統のDNAを採取し、次世代シーケンサーによるバルクDNA解析（Mut-seq法）を行う。耐性系統、感受性系統間で存在比の異なる単塩基変異（SNP）を検出し、既存の低温耐性QTL、低温耐性転写産物との比較を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究費を効率的に使用した結果、次年度使用額となる残額が生じた。特に、次世代シーケンサーによる転写産物の網羅解析費について、業者委託費を、当初の見積もりより低価格にて発注することができた。これは、次世代シーケンサーによる転写産物の網羅解析は、「1. 次世代シーケンサーによる転写産物塩基配列の機械分析」、「2. 分析データのコンピューター解析処理」の作業を含んでおり、これらをまとめて外部委託する予定で見積もりを立てていたが、研究代表者が2016年10月に開催された「農林交流センターワークショップ・次世代シーケンサーの解析技術」を受講することで、「2. 分析データのコンピューター解析処理」を自身で行うことが可能となったため、「1. 転写産物塩基配列の機械分析」のみを外部委託することになり、予定より低価格での委託が可能となったためである。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額1,678,678円は、転写産物の発現量の解析について、解析系統を増やし実験結果をより確固にするために、また、系統のDNAをバルク解析するMut-seq法を新たに行い、形質に影響するゲノム変異箇所を検出し、転写産物との関係を解析するために使用する。
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