| 研究課題/領域番号 |
16K07602
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
嬉野 健次 琉球大学, 農学部, 教授 (10333759)
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| 研究分担者 |
宮島 郁夫 九州大学, 熱帯農学研究センター, 准教授 (20182024)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ツツジ / カロテノイド / CCD4 / 黄色花 |
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| 研究実績の概要 |
常緑性のツツジ亜属種と落葉性で黄色花のPentanthera亜属種との亜属間交配で得られた実生の黄色花色は，ツツジ亜属種より遺伝したCCD4の高発現のため退色化する．昨年度の研究で，交配親のミヤマサツキとキレンゲツツジについて翻訳開始点より下流側のゲノム構造解析を行い，両種とも２つのイントロンが存在するが，いずれもキレンゲツツジのサイズが大きく，特に，第2イントロンで809bpの挿入配列が確認されることを明らかにした．そこで，本年度は，まず，第2イントロンの長さの違いがCCD4遺伝子の発現量に与える影響を明らかにするために，リアルタイムPCRにより第2エキソン―第2イントロン―第3エキソン間でのスプライシング効率を確認した．その結果，第2エキソン―第3エキソン間で設計したプライマーでは，ミヤマサツキの発現量が3倍高かったのに対し，第2エキソン―第2イントロン間で設計したプライマーでは，キレンゲツツジの方が1.3倍高かったことから， CCD4の発現量の差に，第2イントロンのサイズが影響している可能性が考えられた．
次に，昨年度の研究でCCD4の発現量の解析を行ったツツジ亜属の18種計31系統に加え，Pentanthera亜属の4系統について，cDNAのクローニングおよびイントロンのサイズの調査を行った．その結果，ツツジ亜属内の種間におけるCCD4のアミノ酸レベルでの相同性は，97%以上と高かった．また，第2イントロンのサイズについて，CCD4の発現量が低いPentanthera亜属の3系統はいずれもキレンゲツツジと同様の大きさであったのに対し，同亜属で発現量が高い1系統では，小さかった．ツツジ亜属種の第2イントロンのサイズは，CCD4の発現量にかかわらず，いずれもキレンゲツツジに比べ小さかった．このことから，同亜属内におけるCCD4の発現量の差には，他の要因が考えられた．
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| 現在までの達成度 |
現在までの達成度
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度の研究計画でキレンゲツツジおよびミヤマサツキのCCD4のプロモーター領域を含む翻訳開始点より上流域の塩基配列を決定することを予定していたが，先にイントロンサイズの影響を調査した．ミヤマサツキおよびキレンゲツツジのCCD4遺伝子の発現量の差に対する第2イントロンのサイズの影響を調査したこと，ツツジ亜属の18種計31系統のCCD4遺伝子のクローニングおよび塩基配列の解読が終了したことから，おおむね順調に進んでいると判断した．
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は，ツツジ亜属種とPentanthera亜属種とのCCD4発現量の差が，翻訳開始点より上流域(シスDNAエレメント)での塩基置換や挿入，欠失の存在などによりもたらされているかを明らかにするため，キレンゲツツジおよびミヤマサツキのCCD4のcoding領域の塩基配列をもとにプライマーを(２もしくは3種)作成し，ゲノムウォーキングキットをもちいてプロモーター領域を含む翻訳開始点より上流域の単離する．得られた産物をTAクローニング法でクローニングし，塩基配列を決定する．また，ツツジ亜属種のなかでCCD4遺伝子の発現量が低かった種についても同様の調査を行う．
さらに，花弁内におけるCCD4の発現量とカロテノイド含量との関係性の解明のために，CCD4遺伝子の発現解析を行ったツツジ亜属種のうちCCD4遺伝子の発現量が低い種について，開花当日の花弁内のカロテノイド含量および組成を調査する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由 29年度，ツツジ亜属種18種31系統についてCCD4遺伝子のクローニングおよび塩基配列の解読を優先し，予定していたゲノムウォーキングによるプロモーター領域の解析を本年度に行うためである．ゲノムウォーキングは，高価なキットを必要とするため，次年度使用額が生じた．
使用計画 29年度，翻訳開始点より下流側のゲノム構造解析をおこなったミヤマサツキおよびキレンゲツツジについて，ゲノムウォーキングキットをもちいてプロモーター領域を含む翻訳開始点より上流域の単離する．得られた産物をTAクローニング法でクローニングし，塩基配列を決定する．
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