| 研究課題/領域番号 |
16K07623
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| 研究機関 | 明治大学 |
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研究代表者 |
桑田 茂 明治大学, 農学部, 専任教授 (20328967)
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| 研究分担者 |
大里 修一 明治大学, 農学部, 専任講師 (30533228)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | RNA複製酵素 / RNA切断酵素 / RNA編集 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度は，植物ウイルス複製酵素複合体を標的としてタンパク質-タンパク質間相互作用(PPI)阻害活性をもつ人工ペプチド配列をランダムペプチドライブラリーから酵母ツーハイブリッド系を用いて取得した．本年度は，標的のキュウリモザイクウイルス１aタンパク質のMTドメインに結合する２種類のペプチド，２aタンパク質のPol領域とNTP結合領域に結合するそれぞれ2種類と９種類について，baitとpreyを交換して結合能を検定したが，両者間の結合が見られないことからbaitのDNA結合領域ドメインと融合した複製酵素ドメインがpreyの人工ペプチドと転写活性ドメイン融合タンパク質間での結合が考えられた．複製酵素ドメイン単独では取得された人工ペプチドと結合しない可能性が高いことが判明した．そこで，複製酵素結合による抵抗性付与の戦略を転換して，ウイルスゲノムの複製酵素遺伝子をRNAレベルで切断することで抵抗性付与の新たな戦略を構築することを目標とした．そのため，最近注目されているRNA切断活性をもつことが報告されたクラス２タイプ４のCasタンパク質を利用したRNAゲノム編集を利用することとして植物で利用可能なCRISPR/C2c2システムを構築することとした．そこで，真正細菌Leptotricchia shahiiのC2c2遺伝子配列(cas13a)の全長をDNA合成し，アグロバクテリウムバイナリーベクターにクローン化し，さらにcrRNA転写用にシロイヌナズナU6プロモータを付加して，植物用のCRISPR/C2c2システムを構築した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ペプチド-ペプチド間相互作用では，人工ペプチドによるRNA複製酵素ドメインに結合により，複製酵素活性を阻害することが困難であったため，直接複製酵素遺伝子を切断することを目標とした．そのためにCRISPR/C2c2システムを構築することとして，植物形質転換用にバイナリーベクター系を構築することに成功した．
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| 今後の研究の推進方策 |
今回，構築に成功したCRISPR/C2c2システムの有用性を示すために，アルファルファモザイクウイルスやキュリモザイクウイルスの配列をターゲットとするcrRNAを組み込んだバイナリーベクターで形質転換体やアグロインフィルトレーション法でRNA切断活性の検証を行い，新規のRNAウイルス抵抗性付与戦略を構築し，対象ウイルスを増やしてゆく予定である．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
人工ペプチド単独では複製酵素ドメインに結合性がないことから，アルファースクリーニング実験が不必要となったために経費が少なくなった。その経費の一部で人工遺伝子を合成したため。
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