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前年度までの研究で、植物病原菌の殺菌剤感受性株と耐性株の混合DNAサンプルからパイロシークエンス法により耐性比率を算出できる可能性が示された。本年度は、耐性比率の精度を向上させるための検討を行った。耐性比率の算出原理は、変異の有無により変化する塩基種の取り込み量比をルシフェラーゼ発光強度の比として概算する。そこで、5´末端側からシークエンスするアッセイ系に加えて、3´末端側からのアッセイ系を構築した。耐性株と感受性株のDNAを人為的に混合し、2種類のアッセイで比率を算出した。アッセイ系ごとに精度の差はあるものの、両アッセイの結果を平均化することより耐性比率の精度が向上した。
パイロシークエンス法が圃場の耐性モニタリングに有効であるかを検証するために、キュウリ褐斑病の発病圃場（3ヶ所の栽培ハウス）から、発病葉をサンプリングした。まず、各病斑から菌を個別に分離して、耐性変異の有無を診断した。次に、各圃場から収集した発病葉から褐斑病菌の胞子を圃場ごとにまとめて回収し、DNAを調整後に、パイロシークエンス法により耐性比率を算出した。その結果、パイロシークエンス法により圃場単位で解析した耐性比率は、個別の分離株の解析から算出した耐性比率と良好な相関が認められた。このことから、従来のように分離株ごとに遺伝子診断解析することなく圃場単位の耐性菌比率を十分に概算できることが示された。
昨年度に引き続き、トマト葉かび病菌のSDHI剤耐性変異の探索をおこなった。世界の主要な殺菌剤となっているSDHI剤は構造の多様化とともに耐性変異の複雑化がすすんでいる。葉かび病菌のSDHI耐性株は、未だ同定されていない遺伝子に耐性変異をもつことが明らかになった。次世代シークエンサを用いたゲノム解析により耐性変異を同定する準備を完了させた。
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