| 研究課題/領域番号 |
16K07637
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
坂本 一憲 千葉大学, 大学院園芸学研究科, 教授 (10225807)
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| 研究分担者 |
園田 雅俊 千葉大学, 大学院園芸学研究科, 講師 (70376367)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 二重共生系 / ストレス応答 / メタロチオネイン遺伝子 / ダイズ / 根粒菌 / アーバスキュラー菌根菌 |
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| 研究実績の概要 |
平成29年度はダイズの二重共生系におけるストレス応答遺伝子のひとつであるType1メタロチオネイン（GmMT1）遺伝子の役割解明に関する以下の実験を行なった。
研究代表者である坂本は、ダイズ根および根粒中の金属イオン（亜鉛・銅）含量と平成28年度に確立した方法を用いて過酸化水素発生量を測定し、GmMT1遺伝子が①共生菌の定着に伴う細胞内金属イオンの濃度変動を調整している可能性と、②共生菌の定着によって発生する過酸化水素（活性酸素種）の消去を行っている可能性を検討した。その結果、ダイズ根および根粒におけるGmMT1遺伝子の発現量は、金属イオン含量とは相関関係を示さず、過酸化水素発生量と強い相関関係にあることが明らかとなった。従ってGmMT1の役割として、ダイズ根および根粒中の活性酸素の消去を行っている可能性が示唆された。
研究分担者である園田はGmMT1遺伝子の発現部位の解明を行なった。まずGmMT1遺伝子のプロモーター領域を増幅するプライマーを設計し、これを用いてダイズ根からプロモーター領域を含む配列を増幅した。GUS遺伝子を含むbinary vectorへこれを組み込み、さらにAgrobacterium rhizogenesへ導入した。ダイズの下胚軸に本菌を接種し毛状根を発生させた。毛状根に根粒菌とアーバスキュラー菌根菌を接種し、数週間生育させた後にGUS染色を行なってGmMT1遺伝子の発現部位を特定、観察した。その結果、GmMT1遺伝子はダイズ根では感染しているアーバスキュラー菌根菌の樹枝状体の周囲で主に発現していることが認められ、また根粒中ではバクテロイド感染領域の周囲で発現していることが見出された。以上のことからGmMT1遺伝子は両共生菌に接する部位で発現していることが明らかとなり、本遺伝子は共生特異的に発現していることが明確となった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、ダイズの根粒・菌根二重共生系の成立に必須なストレス応答遺伝子の発現特性とその役割について解析を進めている。平成28年度と29年度に得られた成果は以下のようにまとめられる。
（１）GmMT1遺伝子の発現特性：RT-リアルタイムPCR法を用いてダイズ根および根粒におけるGmMT1遺伝子の発現量を測定することを試みた。その結果、ダイズ根と根粒ともに子実肥大期のGmMT1発現量が開花期よりも高いことを明らかにした。（２）シグナル物質の検出と定量：GmMT1遺伝子の発現を誘導するシグナル物質として活性酸素種のひとつである過酸化水素の検出と定量を試みた。その結果、過酸化水素の特異的染色試薬であるジアミノベンジジンを用いることで、ダイズ根と根粒内の細胞で生成されている過酸化水素の検出に成功した。また画像解析によって過酸化水素発生量の定量化に成功した。（３）GmMT1発現量と金属イオン含量および過酸化水素発生量との関係：ダイズ根および根粒中の金属イオン含量と過酸化水素発生量を測定し、GmMT1発現量との関係について検討した。その結果、GmMT1遺伝子発現量は過酸化水素発生量と強い相関関係にあることが明らかとなり、GmMT1はダイズ根および根粒中の活性酸素の消去を行っている可能性が示唆された。（４）GmMT1遺伝子の発現部位の解明：GUS法を用いてGmMT1遺伝子の発現部位の解明を行なった。その結果、GmMT1遺伝子はダイズ根では感染しているアーバスキュラー菌根菌の樹枝状体の周囲で発現していること、また根粒中ではバクテロイド感染領域の周囲で発現していることが見出された。このことからGmMT1遺伝子は共生特異的に発現していることが明確となった。
以上のような種々の成果が得られたことから、本研究はおおむね順調に進展していると評価される。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度は、引き続きダイズの二重共生系におけるGmMT1の役割解明およびGmMT1を活用したダイズのストレス耐性強化の可能性とその分子基盤について検討する。
坂本はRNAi法を用いてダイズ毛状根の遺伝子発現抑制体を作出し、GmMT1の役割を解明する。まずGmMT1上の特定配列を2本鎖(ds)RNA領域に持つ、short hairpin RNAを生産するコンストラクトを作製する。そしてこれを導入したAgrobacterium rhizogenes MAFF210265株（国内野生株）をダイズ根に接種し毛状根を発生させる。毛状根に根粒菌とアーバスキュラー菌根菌を接種して栽培し、GmMT1遺伝子の発現抑制が根粒着生と菌根形成に及ぼす影響を検討する。本実験は連携研究者の中村の指導・助言を受けながら実施する。
園田は共生菌の接種によるダイズの環境ストレス耐性、特に重金属耐性の強化についてその可能性を調べる。また分子基盤としてGmMT1の遺伝子発現との関係を検討する。実験に供試する重金属はカドミウムおよび亜鉛とし、段階的に重金属を添加したダイズに根粒菌とアーバスキュラー菌根菌を接種して栽培する。経時的にダイズの生育、根粒着生、菌根形成およびGmMT1遺伝子発現量を調べ、ダイズの重金属耐性とGmMT1との関係を検討する。
また平成30年度は最終年度であるため3年間の実験の取りまとめを行い、得られた研究成果は国内外の学会において逐次発表し、学術雑誌への投稿を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
業者との折衝により予定していた額よりも消耗品代が少額で済んだため繰越金が生じた。繰越金分は翌年度分として請求している助成金と合わせて物品費として使用する予定である。
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