研究課題
有機酸をはじめとする膜不透過性化合物の発酵法による物質生産において、化合物を菌体外に排出するエクスポーターは、生産効率を左右する重要な因子である。本研究では、コハク酸排出輸送体SucE1をはじめとする有機酸の排出輸送体の属するAAExファミリートランスポーターの構造と基質輸送メカニズムの解明を目指し、平成29年度は以下の研究を実施した。(A-2)結晶化条件の探索と結晶構造解析：平成28年度に実施した結晶化に適したホモログの探索の結果、発現量や熱安定性の優れたホモログについて、大腸菌を宿主として発現、界面活性剤を用いて可溶化後、アフィニティー精製により精製を行った。精製タンパク質を様々な条件下で加熱処理し、未変性タンパク質の残存量をゲルろ過クロマトグラフイーにより定量する手法により、タンパク質の安定化条件の探索を行った。次に、タンパク質にとって最も安定と考えられる条件下で、タンパク質を精製し、ゲルろ過クロマトグラフィーにより高純度タンパク質を得た。得られた高純度タンパク質を膜タンパク質用結晶化条件スクリーニングキットを用いて、結晶化条件のスクリーニングを行った。いくつかの条件下で、微細な結晶を得ることができ、現在、これらの条件を元に、さらに詳細に結晶化条件の最適化を進めている。(B)AAExトランスポーターの機能に重要なアミノ酸残基の探索：平成28年に引き続き、AAExトランスポーターの機能に重要なアミノ酸残基の探索系の構築を行った。液体培養、HPLCによる化合物分析により、トランスポーターの機能を明確に判別できる実験系を確立した。
2: おおむね順調に進展している
(A)AAExトランスポーターの結晶構造解析について、平成28年度にひきつづき安定化条件の探索を進め、タンパク質が安定的に存在できる条件を決定した。さらに、安定条件下で精製を行い、結晶化条件の探索を行った。その結果、微細な結晶を得るに至り、進捗は順調であると考えている。一方で、(B)機能に重要なアミノ酸残基の探索については、実験系の確立に時間を要した。より効率的に研究を進めるために、新たな実験系を含めて機能に重要なアミノ酸残基の探索を進める。
(A)AAExトランスポーターの結晶構造解析について、現在得られている微細結晶の得られた条件を元にさらに良質な分解能を得られる結晶化条件の探索を実施している。高い分解能を得られる結晶を作製するために、引き続き沈殿剤の種類、濃度、添加剤、界面活性剤等の検討を実施する。(B)機能に重要なアミノ酸残基の探索については、より効率に実験を進めるために、これまで開発を進めている大腸菌を宿主としたin vivoスクリーニングに加えて、人工脂質二重膜等を使ったin vitroスクリーニング系の構築と機能に重要なアミノ酸残基の探索も進める予定である。
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Journal of Bioscience and Bioengineering
巻: 印刷中 ページ: 印刷中
10.1016/j.jbiosc.2017.12.007
Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry
巻: 81 ページ: 1837～1844
10.1080/09168451.2017.1345612
