Small RNAによるキチン分解利用遺伝子群の連動的発現制御ネットワークの解明

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K07659
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 鈴木 一史 新潟大学, 自然科学系, 准教授 (00444183)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 遺伝子発現 / small RNA / 応用微生物学 / キチナーゼ

研究実績の概要

本研究の目的は、細菌のキチン分解利用系（キチン分解酵素及びキチン結合タンパク質の生産、分解産物の取り込み、分解産物の代謝）がsmall RNAの仲介によって連動して制御される新たな遺伝子発現調節機構を解明することである。Serratia marcescensにおいてキチン分解利用系が発現していない時、Small RNA ChiXが転写因子ChiRをコードするchiRのmRNA 5′非翻訳領域（UTR）に結合し発現を抑制していると考えられる。キチン分解利用系が発現する時は、キトポリンをコードするchiPが発現し、ChiXはchiP mRNA 5′UTRに結合し、chiRの発現抑制が解除される。ChiXがこれらmRNAと塩基対を形成する領域に変異を加えたところ、１塩基の置換でキチナーゼ分解利用系に影響を及ぼした。よって、これらのmRNAとChiXとの塩基対形成が重要であることが明らかとなった。さらに、chiP 5′UTRの発現によってchiRの発現抑制が解除される際、chiP mRNA 5′UTRは大量に発現しているにもかかわらず、ChiXは大幅な減少が認められずに存在していた。一方、chiR 5′UTRを発現させてもchiRの発現抑制は解除されず、chiR mRNA 5′UTRは検出されなかった。大腸菌のChiXやchiP 5′UTRとの塩基配列の違いが認められること、また、chiPとchiRの5′UTRの塩基配列の比較から、ChiXとchiP及びchiRのmRNAとの相補配列のみならず、それら周辺の塩基配列がS. marcescensにおけるChiXによるキチン分解利用系制御に影響を及ぼすと考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

今年度はChiXとchiP及びchiR mRNAとの塩基対形成と翻訳制御及びchiP 5’UTR発現によるchiR抑制解除を中心に研究を進め、chiX破壊株においてChiXのmRNAとの塩基対形成に必要な一本鎖領域に変異を加えた変異ChiXによるキチナーゼ及びキトビアーゼの生産性を調べるとともに、chiR・chiP・３種のキチナーゼやCBP21遺伝子の発現をRT-PCRで調べた。また、chiP 5’UTRに加え、chiR 5’UTRを発現するプラスミドを構築し、S. marcescensで発現させることによりchiR抑制解除メカニズムの一端を明らかにすることができた。chiPとchiRの調節領域の塩基配列の解析から、Hfqが関与するメカニズムを予測することができ、これらを確認する実験を計画中である。そこで計画を前倒ししてhfq破壊株の構築を試みている。転写因子ChiRが発現を制御するタンパク質の検出を試みたが明瞭な結果は得られておらず、ChIPアッセイ等によってChiRのターゲットを探索する計画である。

今後の研究の推進方策

ChiX, chiP 5’UTR, chiR 5’UTRの安定性及び結合機構：大腸菌やサルモネラのChiXはchbオペロンmRNAの遺伝子間領域に結合することで不安定化が生じ分解されるが、S. marcescensのChiXにはそのような機構は存在しないため、S. marcescens ChiXによるchiP及びchiRの制御機構には新たなメカニズムが関与していると考えられる。すでにchiP mRNAの5’UTR領域がその下流領域よりも安定であることを見出しており、この安定化がChiX捕捉によるものかどうかをノーザンブロットやRT-PCRで調べる。
ChiXのターゲットの切替えとHfqの関与：ChiXとchiP 5’UTRの発現によりChiXのターゲットはchiRからchiPへ移行する。これにはRNAシャペロンであるHfqが重要な役割を果たしていると考えられる。hfq破壊株構築が困難であることから、Hfqが関与すると考えられるchiRとchiP 5’UTRへの変異導入実験を進める。
nagE破壊株におけるキチナーゼ発現との関係：GlcNAcのPTSをコードするnagE遺伝子の破壊株を、GlcNAcを炭素源として培養するとキチナーゼが生産される。この条件下でのchiP, chiR, chiX等の遺伝子発現及びキチナーゼやキトビアーゼの生産を調べる。
ChiRが結合する塩基配列と直接制御する遺伝子の探索：ChIPアッセイ等によってChiRのターゲットを探索する。
結晶性キチン分解産物の影響：結晶性キチンや水溶性キチン、キチンオリゴ糖などを炭素源として培養し、キチナーゼ遺伝子の発現と菌体外への分泌の関連性を調べる。

次年度使用額が生じた理由

支払いが４月になったため。

次年度使用額の使用計画

すでに執行済みである。

研究成果

• [学会発表] Regulation of chitin degradation and utilization system by small RNA in Serratia marcescens (2017)
  • 著者名/発表者名: K. Suzuki, H. Sugimoto, and T. Watanabe
  • 学会等名: 4th international symposium on biodiversity: bioactivites, agricultural and pharmaceutical applications
  • 発表場所: Tay Nguyen University (Vietnam・Buon Ma Thuot )
  • 年月日: 2017-01-09 – 2017-01-11
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Serratia marcescensにおけるsmall RNA・ChiXによるキチナーゼ発現抑制とその解除 (2016)
  • 著者名/発表者名: 鈴木一史、南晴香、山岸拓矢、小川知佐奈、佐々木直美、杉本華幸、渡邉剛志
  • 学会等名: 第30回日本キチン・キトサン学会大会
  • 発表場所: ウェスタ川越（埼玉県川越市）
  • 年月日: 2016-08-18 – 2016-08-19
• [備考] 新潟大学農学部 応用微生物学研究室ホームページ
  • URL: http://www.agr.niigata-u.ac.jp/~ksuzuki/ApplMicro/Welcome.html