| 研究課題/領域番号 |
16K07665
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
川口 秀夫 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 特命准教授 (50463873)
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| 研究分担者 |
寺村 浩 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 特命助教 (10645089)
蓮沼 誠久 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 教授 (20529606)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 発酵阻害 / 大腸菌 / 代謝解析 / ソルガム / 発酵 / 代謝工学 / フェニル乳酸 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、大腸菌による発酵生産がバイオマス中のリグニン由来化合物により顕著に阻害される現象に着目している。バイオマス由来化合物による発酵阻害を克服して大腸菌による芳香族化合物発酵を飛躍的に効率化するために、芳香族化合物生合成における基盤代謝であるシキミ酸経路の“発酵阻害”メカニズムの解明に取り組んでいる。
芳香族化合物代謝の発酵阻害物質を特定するために、バイオマス由来成分とその発酵阻害作用を調べている。イネ科のC4植物ソルガムを材料に、複数系統について組成分析を行い、また大腸菌に対するバイオマス酵素糖化液の発酵阻害作用との相関関係を調べることで、フェニル乳酸発酵阻害成分(群)の特定を試みている。また、次年度以降に発酵阻害作用機序を解明するために、シキミ酸代謝中間体の解析法を最適化している。
本年度は、リグニン構成成分の生合成に関与するbmr遺伝子に変異あり／なしのソルガム系統10種以上を選抜した。これらの系統の茎部を希硫酸前処理した固体残渣(バガス)を材料に、構成成分と、酵素糖化後の情勢に含まれる発酵阻害候補化合物を、ガスクロマトグラフィー－質量分析計（GC-MS）により分析した。とりわけ、系統間で含量が顕著に異なる成分に着目し、酵素糖化効率またはフェニル乳酸発酵の阻害作用に対する相関関係を解析した。その結果、酵素糖化効率は品種間の有意差が認められ、bmr変異型の低リグニン品種では糖化効率が増加する傾向が認められた。また、発酵阻害作用についても品種間の有意差が認められ、複数の候補阻害化合物を選定できた。
また、発酵阻害物質によるシキミ酸代謝の変動を調べるために、メタボロームによる解析法の改良を試みた。申請者らがすでに使用している液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析計（LC-MS/MS）による分析法を最適化し、シキミ酸など高極性な代謝中間体を網羅する分析手法を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
実バイオマス（リグニン成分含量が異なる複数の植物系統品種）を材料に、①成分分析による発酵阻害物質の特定、②発酵生産のメタボロームによる阻害作用点の特定、③阻害作用点の代謝改変による発酵阻害の克服、の３つの研究項目を計画している。これらの研究課題を通じて、医薬品や高機能ポリマーの原料となる芳香族化合物をバイオマスから生産するための基盤となる宿主を創出することを企図している。初年度である今期は、実施項目①を実施し、さらに実施項目②の基盤技術確立に取り組んだ。
今回使用した16品種のソルガムバガスでは、構成成分（セルロース／ヘミセルロース／リグニン）、酵素糖化効率、大腸菌のフェニル乳酸発酵に対する阻害について、品種間での有意差が認められたことから、試験材料としての適切な植物種の選定は当初予定通りに完了することができた。また、これらのバガス利用の評価に必要な解析技術、すなわち、成分分析、酵素糖化、微視生物発酵、メタボローム解析についても、当初予定通りに基盤技術を確立することができた。
酵素糖化液に含まれるバガス由来化合物と発酵阻害作用との相関関係については、複数成分による複合的な影響の関与が予想される。今期は、成分分析と酵素糖化効率、発酵阻害についての評価を予定通り実施することができた。今回得られた各因子の定量的結果から相関関係を特定するためには、さらに、得られたデータを主成分分析等の統計学的手法により統合解析し、各因子の中からより影響力の強い因子を抽出する作業を行う必要がある。
発酵阻害の作用機序を調べるためのメタボローム解析については、LC-MS/MSを用いた分析手法と、サンプルの前処理に関する基盤技術を、当初計画どおりに確立することができた。次に予定している代謝解析を速やかに実施する環境は整っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
①成分分析による発酵阻害物質の特定
本年度使用した16品種のソルガムバガスの中から、酵素糖化効率または発酵阻害作用を指標に有意な濃度差のある品種を選抜し、より詳細な解析を進める。具体的には、バガス酵素糖化液に含まれる発酵阻害成分の濃度を定量比較し、発酵阻害物質として作用する植物由来成分を、主成分分析を通じて推定する。推定された候補化合物は、発酵培地に添加して阻害作用を調べることで、作業仮説を検証する。
②発酵生産のメタボロームによる阻害作用点の特定
実施項目①で選抜したソルガム酵素糖化液を用いたフェニル乳酸発酵のメタボローム解析を行う。これにより、代謝中間体レベルにプロファイルの顕著な違いが認められる代謝ステップを発酵阻害作用点として特定する。さらに、課題①で特定した発酵阻害物質を個別に添加して代謝プロファイルの変動を調べ、各成分に特異的な阻害感受性酵素反応（発酵阻害作用点）を特定し、その阻害メカニズムを推定する
③阻害作用点の代謝改変による発酵阻害の克服
特定した阻害作用点の酵素反応を遺伝子組換えにより機能改変する。阻害感受性酵素を高発現した、あるいはフィードバック阻害脱感作型に置換した、代謝改変大腸菌を作製する。阻害条件におけるフェニル乳酸収率の改善を指標に、発酵阻害を克服した大腸菌を選定し、有効な代謝改変デザインを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
項目②代謝解析の研究を前倒しで完了した。
実サンプルの選定は、項目①成分分析による発酵阻害物質の特定、の結果を待って決定する必要があったため、実施に必要な消耗品の購入を翌年度に持ち越した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
代謝解析に使用する試薬等の消耗品の購入補充費用として使用する。
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