| 研究課題/領域番号 |
16K07665
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
川口 秀夫 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 特命准教授 (50463873)
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| 研究分担者 |
寺村 浩 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 特命助教 (10645089) [辞退]
蓮沼 誠久 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 教授 (20529606)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 大腸菌 / 発酵阻害 / ソルガム / バイオマス / 酵素糖化 / 代謝工学 / メタボローム |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、大腸菌による発酵生産がバイオマス中のリグニン由来化合物により顕著に阻害される現象に着目している。バイオマス由来化合物による発酵阻害を克服して大腸菌による芳香族化合物発酵を飛躍的に効率化するために、芳香族化合物生合成における基盤代謝であるシキミ酸経路の“発酵阻害”メカニズムの解明に取り組んでいる。
芳香族化合物代謝の発酵阻害物質を特定するために、バイオマス由来成分とその発酵阻害作用を調べている。イネ科のC4植物ソルガムを材料に、複数系統について組成分析を行い、また大腸菌に対するバイオマス酵素糖化液の発酵阻害作用との相関関係を調べることで、フェニル乳酸発酵阻害成分(群)の特定を試みている。また、次年度以降に発酵阻害作用機序を解明するために、シキミ酸代謝中間体の解析法を最適化している。
本年度は、リグニン構成成分の生合成に関与するbmr遺伝子に変異あり／なしのソルガム系統16種を選抜し、酵素糖化に与える影響評価と糖化により遊離する発酵阻害物質の測定を行なった。ソルガムの茎部を1%希硫酸で前処理することで得られる固体残渣（バガス）を用いて、主成分分析と、酵素糖化、表面電荷を測定した。bmr変異型の低リグニン品種では、野生型と比べて酵素糖化効率が顕著に増加し、表面電荷の有意な変化が認められた。また、バガス由来の発酵阻害候補化合物をガスクロマトグラフィー－質量分析計（GC-MS）により分析した結果、品種間の有意差が認められる化合物を複数特定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
実バイオマス（リグニン成分含量が異なる複数の植物系統品種）を材料に、①成分分析による発酵阻害物質の特定、②発酵生産のメタボロームによる阻害作用点の特定、③阻害作用点の代謝改変による発酵阻害の克服、の３つの研究項目を実施する。これらの研究課題を通じて、医薬品や高機能ポリマーの原料となる芳香族化合物をバイオマスから生産するための基盤となる宿主を創出することを企図している。本年度は、実施項目①に関連して、基質となるバガスの物理化学的特性の解明と酵素糖化効率を重点的に実施した。
本年度の16品種のソルガムバガスの評価を通して、構成成分（セルロース／ヘミセルロース／リグニン）と酵素糖化効率の観点から、バイオマスとしての有用品種を当初予定通りに選定することができた。また、今回発酵阻害候補化合物の遊離が多い品種を特定できたことで、次年度以降に実施を予定している発酵阻害評価に最適な品種の選定も完了した。
酵素糖化液に含まれるバガス由来化合物と発酵阻害作用との相関関係については、構成成分（セルロース／ヘミセルロース／リグニン）の差異の他にも、複数因子の影響が示唆された。そこで、主成分分析を用いてすべての測定値を統合的に解析した結果、16品種のソルガムを２グループに分類することができ、かつ発酵阻害強度と正の相関を示す因子を抽出することができた。
発酵阻害の作用機序を調べるためのメタボローム解析については、LC-MS/MSを用いたメタボローム解析手法はすでに開発済みであり、次年度より予定している代謝解析を速やかに実施する環境は整っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究課題は、発酵阻害評価の遅れを除いて概ね予定通り進行している。３つの実施項目の今後の推進方策を以下に記す。
①成分分析による発酵阻害物質の特定：主成分分析により２グループに分類されたソルガムバガスの比較を通じて、発酵阻害と正の相関あるいは負の相関を示すバガス由来の“発酵阻害”マーカーを特定することを目指す。特に、本年度主成分析から発酵阻害との正の相関が示唆された化合物について、その妥当性を検証する。
②発酵生産のメタボロームによる阻害作用点の特定：実施項目①で選抜したソルガム酵素糖化液を用いて、フェニル乳酸発酵のメタボローム解析を行う。これにより、代謝中間体レベルにプロファイルの顕著な違いが認められる代謝ステップを発酵阻害作用点として特定する。シキミ酸経路における阻害作用点が特定された後は、課題①で特定した発酵阻害物質の個別添加による代謝プロファイルへの影響を調べて、化合物特異的な阻害感受性酵素反応（発酵阻害作用点）を明らかにする。
③阻害作用点の代謝改変による発酵阻害の克服：特定した阻害作用点の酵素反応を、遺伝子組換えにより機能改変する。阻害感受性酵素の高発現、あるいはフィードバック阻害脱感作型への置換により、発酵阻害耐性に対する有効性を検証する。また、阻害条件におけるフェニル乳酸収率の改善を指標に、発酵阻害を克服した大腸菌の構築を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
バイオマス評価についての興味深い知見が得られたので、予定していた解析をさらに掘り下げて実施し、有用なデータを得ることができた。その結果、当初予定していた発酵阻害の評価に遅れが生じ、これを翌年度実施するために必要な予算を繰り越すこととした。
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