| 研究課題/領域番号 |
16K07666
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
高坂 智之 山口大学, 大学院創成科学研究科, 助教 (70500453)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | コハク酸脱水素酵素 / プロピオン酸酸化細菌 / 水素生成 |
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| 研究実績の概要 |
平成29年度は前年度に引き続き、2) 反応に必要な補因子の探索、4-1) コハク酸脱水素酵素(SDH)の解析を実施した。また新たに、4-3)大腸菌を利用したSDHの発現と解析及び5-2)他の菌株を利用したHYDの発現と解析も実施した。成果としては、SI株のSDH1及びSDH2の機能的特徴を見出そうと試みたところ、SDH1がSI株においてコハク酸脱水素酵素として機能していること、また、プロピオン酸からの水素放出にはSDH1が関与することが示された。一方、NADHを電子供与体とするフマル酸還元活性が可溶性画分で確認されたことから、SDH2はフマル酸レダクターゼとしての機能を有する可能性が示唆された。これら一連の解析の結果、プロピオン酸酸化時のコハク酸酸化経路はほぼ特定できていると考えている。さらに、どの培養条件でSDH1及びSDH2が高発現しているのかを確認したところ、SDH1は基質がピルビン酸の時の対数増殖期、SDH2は基質がフマル酸の時の対数増殖期に高い可能性が示唆された。しかしながら、プロピオン酸からの水素放出への補酵素の添加は明確な効果が確認出来なかった。そして、大腸菌でのSDHの発現は、大腸菌のSDH破壊株にSI株のSDH1及びSDH2をオペロンとして含むプラスミドを構築して導入した。ほぼ同様に構築したプラスミドによる大腸菌SDH発現での機能補完は確認できたが、SI株のSDH活性及び機能的補完は確認できなかった。また、大腸菌でのSI株のヒドロゲナーゼ (HYD) の発現を目指し、大腸菌にある3つのヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を全て破壊した株の構築を完了した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成29年度は、1)コハク酸酸化の膜電位要求性の細胞での確認, 2) 反応に必要な補因子の探索, 4-1) コハク酸脱水素酵素(SDH)の解析をほぼ完了させた。さらに、4-3)大腸菌を利用したSDHの発現と解析と5-2)他の菌株を利用したHYDの発現と解析を実施し、大腸菌においてSDHの機能解析を実施できる道筋をつけた。ただ、3)膜小胞や反転膜小胞による解析 や、4-2) で計画していた精製を行って機能解析をすることは実施できていない。特に、5-1) で計画していたHYDの機能解析を行うための解析系の構築を急ぐ必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
大腸菌でのSI株のSDH及びHYDの発現を平成30年度の早い段階で実現させることで、それぞれの遺伝子の機能解析を大腸菌で実施可能にしたいと考えている。また、SDH発現プラスミド構築と大腸菌破壊株構築で培った技術を活用する予定である。さらに、部分的な酵素精製はSDHに関しては膜を回収する条件を改めて検討していることから、以前より安定して酵素の精製をすることが可能であると期待している。大腸菌での発現とSI株を用いた酵素の機能解析を並行して行い、SI株の有する特徴的なコハク酸酸化からの水素生成機構の詳細を明らかにしていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
使用しているクリーンベンチに不具合が発生したためその修理の見積を取ったところ、修理部品の調整に3ヶ月必要であり年度内の発注が早期修理に向けて必要となったため、発注だけを前倒して行い修理費は次年度に繰り越した。
次年度この予算は、クリーンベンチの修理に使用する予定である。
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