| 研究課題/領域番号 |
16K07672
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
二神 泰基 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 准教授 (60512027)
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| 研究分担者 |
玉置 尚徳 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 教授 (20212045)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 白麹菌 / クエン酸 / 有機酸 / トランスポーター / 交換輸送体 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は白麹菌のクエン酸高生産機構の一端を解明することを目的としている。白麹菌のゲノムにおいてクエン酸合成酵素遺伝子（citA）の近傍に保存されている推定クエン酸-オキソグルタル酸対向輸送体遺伝子（yhmA）と推定RNA結合タンパク質遺伝子（nrdA）がクエン酸生産に関与すると推定し、これらの機能解析を行っている。
本年度は、まず、白麹菌のミトコンドリア局在型クエン酸輸送体（CtpAとYhmA）の諸性質を解析した。白麹菌からCtpAとYhmAを精製し、リポソームに再構成して14C標識クエン酸を用いてクエン酸輸送活性を測定した。その結果、CtpAとYhmAは交換輸送活性のみを示し、CtpAはリンゴ酸とcis-アコニット酸を対向基質としてクエン酸輸送活性を示し、一方、YhmAはリンゴ酸、cis-アコニット酸、オキソグルタル酸、オキサロ酢酸、コハク酸を対向基質としてクエン酸輸送活性を示した。
次に、昨年度、白麹菌においてctpAとyhmAのそれぞれを破壊すると、菌体あたりのクエン酸生産量が減少することを報告した。そこで、本年度はctpAとyhmAの二重破壊株の構築を試みたが取得できなかったため、合成致死となることが示唆された。以上から、まず、Tet-Onシステムを用いてctpAのコンディショナル発現株を構築して、当該株のyhmA遺伝子を破壊した。本株の表現型を観察した結果、ctpAとyhmAの二重破壊条件が最小培地では合成致死であり、リジン要求性となることが明らかとなった。また、培地へのリジン添加によりクエン酸生産が抑制されることを見出した。
以上の結果から、CtpAとYhmAがクエン酸高生産に関与するクエン酸輸送体であり、ミトコンドリアから細胞質へのクエン酸輸送がリジン合成に関与することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予定通りクエン酸輸送体タンパク質の酵素活性を測定できた。また、クエン酸輸送とリジン合成との関連に関する新しい知見が得られたため、 “おおむね順調に進展している”とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
来年度はクエン酸合成酵素遺伝子（citA）の上流に保存されているRNA結合タンパク質遺伝子（nrdA）を主に解析する。昨年度に行ったnrdAのコンディショナル発現株を用いた実験の結果から、nrdAが必須遺伝子であることが明らかになっている。そこで、NrdAとクエン酸生産との関連を明らかにするために、nrdAの発現量の変化がクエン酸生産性や表現型に及ぼす影響を解析する。次に、NrdAと相互作用するRNAを同定するために、RNA immunoprecipitationとシーケンス解析を行う。
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