| 研究課題/領域番号 |
16K07691
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| 研究機関 | 広島工業大学 |
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研究代表者 |
中井 忠志 広島工業大学, 生命学部, 准教授 (00333344)
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| 研究分担者 |
岡島 俊英 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (10247968)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 翻訳後修飾 / 補酵素の生合成 / ラジカルSAM酵素 / 分子内チオエーテル架橋 / 環状ペプチド / キノヘムプロテイン / ビルトイン型キノン補酵素 / 酵素触媒機構 |
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| 研究実績の概要 |
ラジカルSAM酵素はS-アデノシルメチオニン(SAM)と鉄硫黄クラスターを用いてラジカルを生成し、各種の難化学反応を触媒する。キノヘムプロテインアミン脱水素酵素の翻訳後修飾に関わるラジカルSAM酵素QhpDは、最小サブユニットQhpC内の特定のCys残基と、Glu・Asp残基間にチオエーテル架橋を3ヵ所形成する。一般的にペプチドは環状化により様々な生理機能が付与されることが知られており、分子内架橋によりペプチドを環状化するQhpDの触媒機構を解明することは、新規の機能性環状ペプチドを創出することに繋がると期待される。私たちはこれまでにQhpDを用いて、リーダー配列と1つの架橋部位のみから構成された短縮型QhpC（sQhpC）のin vitro架橋反応系を確立した。今回、sQhpCをベースとした各種コンストラクトを作成し、架橋形成部位間の配列長およびその配列特異性について検討した。
まず、1番目の架橋部位において保存性の高い4残基DPGWをAに置き換え、残基の重要性を解析した。その結果、変異体TTSFAPGW, TTSFDPAW, TTSFDPGAは野生型と同等の被架橋形成能を持つ一方で、変異体TTSFDAGWは被架橋形成速度が野生型の1/10程度に低下していた。さらに、架橋ループを8残基に固定したランダム変異体を用いて解析を行ったところ、ある程度の配列許容性があることを見出した。次に、架橋ループの長さに着目し、複数の変異体を基質として活性を測定した。その結果、架橋ループの長さを任意の配列やAのみの配列で2, 3, 4, 5, 7, および8残基に短縮すると架橋が形成されるが、9残基以上に伸長すると架橋が形成されないことが判明した。これらのことから、QhpDは新規の環状ペプチドを創出するための有用なツールとしての可能性があることが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究実績の概要に記載したとおり、QhpDの基質特異性の解析により、架橋ループの長さを任意の配列やAlaのみの配列で2, 3, 4, 5, 7, および8残基に短縮すると架橋が形成されるが、9残基以上に伸長すると架橋が形成されないことが判明した。このことはQhpDが新規の機能性環状ペプチドを創出するための有用なツールとなることを示唆するため、QhpDの応用展開という面では重要な成果が得られたといえる。その一方で、QhpDの研究を特に優先させたために、QHNDHの生合成機構の研究については、大きな進展は得られなかった。以上の成果を総合すると、「おおむね順調に進展している」が妥当であると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）QhpDの基質特異性の解析とQhpDを用いた生理活性ペプチドの生成：今回、架橋ループの長さを任意の配列やAlaのみの配列で2, 3, 4, 5, 7, および8残基に短縮すると架橋が形成されることが判明したことから、それ以外の配列についてもより詳細な解析を進めるとともに、既知の生理活性環状ペプチドの構築に本系の適用が可能か検討する。特に、HIV-1プロテアーゼ阻害剤配列(CTTILLGYNE)を用いて、環状と非環状におけるHIV-1プロテアーゼ阻害能を調べる。
（２）ラジカルSAMファミリーQhpDの結晶構造解析：QhpDの原子レベルでの反応機構解明を目指して、γサブユニットとの複合体を含むQhpDの結晶化を試みる。精製などと同様に嫌気チャンバー内で、結晶化から液体窒素への凍結保存まで行う。Ｘ線回折測定可能なサイズの結晶が生成した場合には、データ収集を行い、結晶構造を決定する。位相決定は、鉄硫黄クラスター中の鉄原子の異常分散により、容易に行えるものと期待される。最終的に、QhpDの機能解析の研究結果も総合し、鉄硫黄クラスターが関与するチオエーテル架橋形成機構の詳細を解明する。
（３）試験管内反応系を用いたCTQ補酵素およびQHNDH生合成の再現：これまで構築に成功しているγサブユニット前駆体とQhpDの試験管内反応系に、その他のQHNDH生合成酵素群を加えることで、次のステップのγサブユニット前駆体（３本のチオエーテル架橋をもち、リーダー配列はもたない）が得られるか検討する。さらに、この試験管内反応系に、単独で発現精製したαサブユニットを加え、CTQ生成におけるαサブユニット依存性を調べる。このようにして、全ての翻訳後修飾反応を試験管内で再現することで、活性をもつQHNDHの生成を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
大阪大学から広島工業大学への装置の輸送費として準備していたが、年度末の予定が年度初めに変更となり執行が次年度に持ち越しとなったために次年度使用額が生じた。そこで、年度初めに予定通り輸送費として残額を執行することを計画している。
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