| 研究課題/領域番号 |
16K07703
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| 研究機関 | 崇城大学 |
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研究代表者 |
平 大輔 崇城大学, 生物生命学部, 准教授 (00569890)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ヘムタンパク質 / 異種発現 / c型ヘム |
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| 研究実績の概要 |
これまで申請者が所属する研究グループでは、嫌気性アンモニア酸化細菌（anammox 菌）KSU-1株が優占種であるanammox汚泥から、本菌に特有のタンパク質・酵素を複数種類単離・精製し、それらの生化学的詳細を明らかにしてきた。精製した特有のタンパク質・酵素の多くはシトクロムcであり、anammox菌は複数種のシトクロムcを大量発現することが明らかとなってきた。これらシトクロムcはc型ヘムを有するタンパク質であるが、そのヘムはタンパク質と共有結合しており、その成熟には特異な成熟系が必要とされることがわかっている。本研究では、anammox菌のシトクロムc成熟系System IIを対象とし、その生化学的詳細を解明することを第一の目的とした。第二の目的はSystem IIの応用によるマルチc型ヘムタンパク質発現系の実現である。そこで、平成28年度には、シトクロムc成熟系System IIの発現精製法の確立を目的に研究を進めた。anammox菌KSU-1株がもつSystem II遺伝子ResBCをPCR増幅し、複数の大腸菌発現用プラスミドに組込み、ResBC発現用プラスミドを構築した。得られたプラスミドで大腸菌BL21(DE3)を形質転換することで、ResBCを発現させた。培養した菌体を破砕し、SDS-PAGEとヘム染色によりResBCの発現量を確認した。複数の培養条件を検討したが、残念ながら、おそらくResBCが膜タンパク質のため、活性を有するResBCの発現は確認できなかった。そこで、対象のResBC遺伝子を好熱菌由来のものに変更し、同様の発現系を構築し発現を試みた。その結果、膜画分にヘムを有する発現タンパク質が得られた。現在、この画分の活性を確認を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ResBCの発現系を変更することで、今年度の目的であるResBCタンパク質の調製に目途が立ったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の計画通り、ResBCの精製を行い生化学的な性質の解明を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ResBC発現系の構築を十分に検討し、それらための実験試薬に助成金の多くを使用し、当初計画したクロマトグラフィシステムの購入を見送ったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
精製ResBCの調製に目途がたったので、試料の高純度精製に必要なカラム担体購入費用として使用する計画である。
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