| 研究課題/領域番号 |
16K07706
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
水谷 治 琉球大学, 農学部, 准教授 (10443996)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 麹菌 / ゲノム編集 / 人工ヌクレアーゼ (TALENs) / CRISPR/Cas9 / DNA 二本鎖切断修復 / ligD |
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| 研究実績の概要 |
麹菌において人工ヌクレアーゼ (TALENs) を用いて非相同末端結合 (Nonhomologous end joining : NHEJ) の修復エラーを利用したゲノム編集を行うと、得られた株の半分程度で 1 kb 以上の大規模な欠失が引き起こされることを見出している。本研究では、麹菌において、このメカニズムに関与する遺伝子を同定し、なぜゲノム二本鎖切断時にこのような大規模欠失を伴った修復エラーが起きるのかを明らかにすることを目的としている。昨年度の結果より、大規模欠失は、NHEJ 修復経路の末端結合に必要な ligase をコードする ligD 遺伝子が関与していることが示された。これは、当初の予想とは逆で、LigD 依存的な NHEJ 経路が大規模欠失に関与していることが示唆された。本年度は、まず始めに、この現象がターゲット遺伝子の他の領域でも引き起こされるのかを調べた。その結果、ターゲット領域を変更しても大規模欠失は引き起こされることが明らかとなり、ターゲット領域特有の現象ではないことが示唆された。また、 RNA 誘導型ヌクレアーゼのゲノム編集ツールである CRISPR/Cas9 でも同様の現象が観察されるか調べた所、大規模欠失は同様に観察され、ligD 破壊株宿主では、その大規模欠失は抑制された。以上から、ゲノム編集ツールの違い（DNA の切断様式）に関わらず大規模欠失は引き起こされ、その大規模欠失は ligD 遺伝子が関与していることが改めて示唆された。続いて、ligD 遺伝子がゲノム編集ツールによる 2 本鎖切断の修復エラーとして大規模欠失を直接的又は間接的に引き起こしているのかを調べるために、ligD 破壊株を宿主に ligD 遺伝子高発現株を造成し、その大規模欠失の起こる割合が増加するかを検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
麹菌において、TALENs を用いたゲノム編集時に大規模欠失が引き起こされる理由が、当初の予想に反して、NHEJ 修復経路の構成因子である ligase をコードする ligD 遺伝子の関与が示唆された。そこで、NHEJ 修復経路の他の構成因子群（ku や XRCC4 ホモログ等）の遺伝子破壊株を造成し、これら破壊株を宿主にゲノム編集を行い、LigD 以外の NHEJ 修復構成因子が大規模欠失に関与するかを調べる予定だったが、相同組換え効率の低い麹菌野生株を宿主としているためか、目的の相同組換え体を得られていないため、やや遅れているとした。
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| 今後の研究の推進方策 |
麹菌において、TALENs を用いたゲノム編集時に引き起こされる大規模欠失の原因遺伝子の一つと考えられる ligD 遺伝子の関与を明らかにするために、ligD 遺伝子高発現株を宿主にゲノム編集を行い、野生株を宿主にした時よりも大規模欠失が増加するかを調べる。この結果により、LigD が大規模欠失に直接的に関与しているか、間接的に関与しているかを明らかにしていく。また、昨年度の研究より麹菌において CRISPR/Cas9 ツールを用いて NHEJ 修復エラーを介したゲノム編集が、Cas9 酵素及びガイド RNA 細胞内直接導入法により可能であることが分かった。そこで、LigD 依存的な NHEJ 修復機構に関与していると思われる遺伝子群の破壊を、破壊カセットであるドナー DNA と Cas9 酵素、ガイド RNA を細胞内に直接導入することで、相同組換えを効率よく引き起こせるように行っていく。また、得られた破壊株群を宿主に NHEJ 修復エラーによるゲノム編集を行い、大規模欠失との関連性を調べていく。以上から、ligD 遺伝子とともに、NHEJ 経路がどのように大規模欠失に関与しているかについて考察を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
麹菌野生株 (RIB40) を宿主に LigD 依存的 NHEJ 修復経路の構成因子遺伝子群の破壊株造成がうまくいかなかったため、その後の研究を進めることが出来ず、次年度使用額が生じてしまった。
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