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昨年度までに TALENs と 2 本鎖切断様式が異なる RNA 誘導型ヌクレアーゼのゲノム編集ツールである CRISPR/Cas9 でも同様の現象が観察されるか調べた所、大規模欠失が同様に観察された。即ち、麹菌においてゲノム編集ツールの違い（DNA の切断様式）に関わらず大規模欠失は引き起こされることが明らかとなった。大規模欠失が引き起こされる理由として、 NHEJ 修復経路以外の修復機構の影響が強い可能性を予想し、NHEJ 修復経路を遮断した形で TALENs による NHEJ の修復エラーによるゲノム編集を試みた。NHEJ 修復経路の遮断は、修復の最終反応である末端結合に必要な ligase をコードする ligD 遺伝子破壊株を用いた。その結果、ligD 遺伝子破壊株でも野生株とほぼ同程度の割合で、ゲノム編集による変異体が得られた。一方、野生株で観察された大規模欠失が、ligD 破壊株では部分的に抑制されていた。つまり、当初の予想とは逆で、ligD 依存的な NHEJ 経路が大規模欠失に関与している事が示唆された。また、CRISPR/Cas9 を用いたゲノム編集でも同様に、大規模欠失が抑制された。本年度は、ligD 遺伝子を制御することで、ゲノム編集時に大規模欠失を自由に引き起こすことが可能か調べる目的で、ligD 遺伝子高発現株を造成し、その大規模欠失の起こる割合が増加するかを検討した。TALENs を用いたゲノム編集を行ったところ、ゲノム編集候補株自体が全く取れなかった。この結果より、ligD 遺伝子高発現株の表現型の解析、高発現用プロモーターの検討等が必要であることが示唆された。一方、研究の過程で大規模欠失が抑制される株を我々のストック株から偶然に見出すことが出来た。今後は、ligD 遺伝子の解析と共に大規模欠失抑制変異株のゲノム解析を行うことで、大規模欠失のメカニズム解明を進めていきたい。
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