| 研究課題/領域番号 |
16K07714
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| 研究機関 | 横浜国立大学 |
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研究代表者 |
武田 穣 横浜国立大学, 大学院工学研究院, 准教授 (40247507)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | マイクロチューブ / Thiothrix / 伸長パターン / 微細構造 / デオキシ糖 / グルコサミノグルカン |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、マイクロチューブ形成細菌であるThiothrix niveaおよびThiothrix fructisivoransが形成するマイクロチューブの化学構造、微細構造、伸長パターンを明らかにすることにより、新規な微細成形技術確立への足掛かりを得ることである。平成28年度の目標は、「マイクロチューブの伸長パターンの観察」「マイクロチューブの微細構造の観察」「T. niveaのマイクロチューブに含まれるデオキシ糖の精製」「T. niveaのマイクロチューブに含まれるグルコサミノグルカンのNMR測定」である。
マイクロチューブの伸長パターンについては、マイクロチューブに豊富に存在するアミノ基を活用したN-ビオチン化を介した生菌体（菌糸状）の抗体染色によって、マイクロチューブが菌体全域で一様に伸長することを明らかにした。さらに、マイクロチューブの内包される細胞列の伸長パターンについても、細胞膜の蛍光染色によって視覚化し、やはり菌体全域で一様に細胞分裂が起こることを見出した。マイクロチューブの微細構造の観察にあたっては固体化窒素による急速凍結置換法を適用し、マイクロチューブが緻密な単層であることを確かめた。また、化学固定法ではマイクロチューブの変形を来し多層と誤認する恐れがあることも示した。
デオキシ糖の精製については当初、誘導体化して精製する手順を確立を目指し、これを確立した。しかしながら、この方法では糖分子特有の環状構造が失われてしまうため、誘導体としての構造決定に至ったとしても単糖自体の構造を完全に把握することはできない。そこで、デオキシ糖が微弱ながらも有する疎水性に着目し、逆相HPLCを用いて誘導体化することなく精製する方法を考案した。
グルコサミノグルカン溶液のNMR測定でプロトン間距離の推算したところ、2分子会合を示唆するデータが得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初掲げた、「マイクロチューブの伸長パターンの観察」「マイクロチューブの微細構造の観察」「T. niveaのマイクロチューブに含まれるデオキシ糖の精製」「T. niveaのマイクロチューブに含まれるグルコサミノグルカンのNMR測定」の目標はいずれも達成することができ、成果の一部を論文で公表するに至った。
「マイクロチューブの伸長パターンの観察」については、Thiothrix属のマイクロチューブが挿入型伸長（内部伸長）によって形成されることを立証し、付加型伸長（末端伸長）で形成されるSphaerotilus-Leptothrixグループのマイクロチューブとは異なった機構で形成されることを示した。したがって、当初の目標を達成したといえる。
「マイクロチューブの微細構造の観察」は従来用いられていた化学固定法と新たに導入した凍結置換固定法を比較することによって、マイクロチューブ観察における凍結置換固定法の優位性を示すことができた。ただし、必ずしも理想的な固定ができたとはいえず、その原因は意図したほどの急速凍結が実現できていなかったことにあると考えている。したがって、当初の目標をある程度達成したと評価すべきである。
「デオキシ糖の精製」については誘導体化せずに精製することに成功したことから、当初の想定よりも順調に推移しており、当初の想定を上回る進展があったと考えている。
「グルコサミノグルカンのNMR測定」については、すべてのカーボンおよびプロトンシグナルの帰属に成功し、近接しているプロトン核の距離の算出にも至った。グルコサミノグルカン分子は会合体として溶解している可能性があることがわかり、今後に予定している計算化学的解析の指針を得ることができた。したがって、順調に進展しているといえる。
上述のように、全体として研究は順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度の達成目標はほぼ達成されたので、平成29年度も基本的には当初の計画にしたがって研究を進める。しかしながら、T. niveaのマイクロチューブに含まれるデオキシ糖の同定については、当初の計画とは異なり誘導体化せずに精製する手順を確立できたので、誘導体ではなくデオキシ糖そのものを結晶化する方法を模索することとする。さらに、結晶化に至らなかった場合でも、デオキシ糖そのものであれば溶液の高感度NMR測定によって程度の構造情報（例えば環構造の確認）を得ることができる。そこで、デオキシ糖に対する溶液NMR測定（異核2次元NMR測定）も試みる予定である。
デオキシ糖とグルコサミノグルカンとの結合位置の特定はメチル化分解とGC/MS分析で行う予定だが、明確なシグナルが得られなかった場合には、おおよその位置しか特定できないもののより確実に結果が得られるスミス分解を試みる。
T. niveaのマイクロチューブのN-アセチル化度の測定については、当初の予定に従ってHPLCとNMRを組み合わせることによって試みる。
グルコサミノグルカンの安定構造予測ではNMR測定で示唆された2分子会合の分子動力学シミュレーションでの検証を目指す。糖質系高分子の安定構造及び会合に関する分子動力学シミュレーションは必ずしも容易ではないのが現状である。そこで、シミュレーションを支援するプログラムの開発の必要性も念頭に置きながら検証作業を進める予定である。
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