| 研究課題/領域番号 |
16K07735
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
佐藤 健司 京都大学, 農学研究科, 教授 (00202094)
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| 研究分担者 |
自見 至郎 福岡大学, 医学部, 講師 (30226360)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 線維芽細胞 / コラーゲン / Pro-Hyp |
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| 研究実績の概要 |
申請者のグループではコラーゲンペプチドの摂取により血中で増加するPro-Hypが線維芽細胞を増殖促進すること示してきた。本研究はPro-Hypの線維芽細胞増殖促進効果のメカニズムを明らかにすることを目的とした。これまでに線維芽細胞はプラスチック上ではFBS存在下で増殖するが、コラーゲン繊維に接着した場合は増殖が止まり、Pro-Hypの添加で増殖が再開することを見出した。このためコラーゲン繊維に接着した場合に各種増殖因子に対する受容体の発現が減少し、Pro-Hypの添加でさらに発現するのではないかという仮説を立てた。この仮説の検証のため、コラーゲン上の線維芽細胞を回収して、各種受容体の発現の検出を試みた。しかしながら、コラーゲンに接着している線維芽細胞の増殖が抑制されているため、十分な量の細胞が回収できなかった。そのため、コラーゲンゲル上の線維芽細胞上の受容体を直接抗体で検出することを試みた。しかし、ゲル上の線維芽細胞を直接倒立型顕微鏡で観察することは困難であった。そのため、96穴のプレートにコラーゲンゲルを作成し（厚み3mm）、線維芽細胞を培養後固定し、細胞をコラーゲンゲルごと取り出し、細胞側を下にしてグラスに接着して顕微鏡観察を行った。コラーゲンゲルの存在のため位相差での細胞の検出は困難であったが、DAPIにより核を蛍光染色することで細胞の位置を確認し、他の波長で受容体を認識する抗体を検出することに成功した。この手法を用いて、線維芽細胞に低親和性神経増殖因子(p75NTR)の発現を確認することができた。またPro-Hypの添加でp75NTR発現細胞が増殖することも見出した。今後は他の受容体に対する抗体を用い、Pro-Hypの添加による受容体の発現を確認してゆく。また動物でも創傷治癒時にPro-Hypが生成したことを見出し、in vivoの創傷治癒系が確立できた。。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
コラーゲンゲル上では線維芽細胞の増殖が抑制されるため、十分な量の細胞を採取することができず、当初手間取ったが、細胞をDAPIで染色し、その細胞が目的の受容体を発現することを抗体を蛍光で検出することで可能にした。またその際、細胞の培養基質のコラーゲンゲルごと固定後、取り出しグラス上に逆に接着させるという簡単であるが前例のない手法で可能にした。この手法の確立が29年始めであったが、その後は順調に受容体の発現を評価できている。
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| 今後の研究の推進方策 |
28年度で確立した手法を用いて研究を進行することが可能であると考えている。その際に、コラーゲンゲルが盛り上がっている場所に p75NTR発現線維芽細胞が集中していることを見出した。おそらくコラーゲンゲルにかかる張力が線維芽細胞の受容体発現に影響していることが示唆される。この現象は当初は想定していなかったが、創傷治癒において重要な意味を持つ可能性があるので、培養基質のコラーゲンゲルの張力に関しても今後検討を行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
京都大学（佐藤）での細胞実験が手間取ったため、福岡大学（自見）での動物実験が予備試験しか行われなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
28年度の研究により京都大学での細胞実験で各種の受容体の発現が異なる線維芽細胞を見出し、またPro-Hypの添加で、コラーゲン上での細胞数の増加、p75NTRの発現の増加が観察されたため、福岡大学でマウスモデルでの再現を行う。そのために福岡大学において動物実験に繰り越し分を使用する。
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