2016 年度実施状況報告書

セルロース繊維に蛋白質機能を付与する基盤技術開発

研究課題

研究課題/領域番号	16K07818
研究機関	国立研究開発法人産業技術総合研究所
研究代表者	星野英人国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (20371073)
研究期間 (年度)	2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード	人工タンパク質 / セルロース・蛋白質ハイブリッド / 高度化利用 / プロテアーゼ活性
研究実績の概要	超耐熱性キチン／セルロース結合ドメイン（hCBD）を蛋白質機能のアダプターとして用いて、１）オリジナル技術の“hCBD-BAF／セルロース基材複合材”を活用したプロテアーゼ活性センサー技術を実用化レベルに高める、２）hCBDを介して“蛋白質機能”をバイオマス繊維基材に付与する成功事例を増やし、バイオマス繊維素材の高機能化技術としての汎用可能性を検討することを目的として当該課題を遂行した。１）に関しては、一般的な風邪ウィルスのプロテアーゼであるHRV-3Cを対象とした予備研究から抽出された、プロテアーゼセンサー技術の最大課題である、セルロース基材からのセルロース繊維の脱落に依存する、発光活性の高いバックグラウンド軽減の取組を市販セルロース基材製品から、ベターな製品を選択するに至った。また、風邪ウィルスよりも社会的な訴求性があるSARSコロナウィルスを対象としたプロテアーゼ活性の検出系の検討のため、SARS-3CLプロテアーゼの大腸菌での発現と精製を開始し、プロテアーゼ活性の確認には至っていないものの、概ね順調に進めることができた。２）に関しては、ストレプトアビジン（SA）派生体を最初の候補蛋白質として考え、Strep-tagIIを有する“蛋白質を選択的に捕捉する紙”の開発を狙ったが、hCBD-SA派生体融合蛋白質の大腸菌発現が不調であり、当該課題解決に難航している。劇的な改善の見通しが立たないため、当該年度途中に当初次年度計画に想定していた“hCBDを介して紙素材に抗体を選択的に固着させる取り組み”を前倒しして開始した。これまでのところ、概ね順調に進められている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由研究１）に関しては、予備的研究からプロテアーゼ反応条件下での激しい振盪によるセルロース繊維の濾紙からの脱離に依存する、高いバックグラウンドの問題があり、激しい振盪条件下でもhCBD-BAF/紙複合材から繊維脱落を最小にするセルロース素材の選定を進めた。その結果、年度末に漸く市販の製品サンプルから、適当な紙素材を見出すに至った。また、同素材の最適化を進めつつ、大腸菌におけるSARS-3CLプロテアーゼの安定発現系と精製系の構築を併行して検討した。先行文献（Akaji K et.al., Bioorg. Med. Chem., Vol 16, 9400-9408, 2008）を参考にしたが、大腸菌内での発現用融合タグや蛋白質発現条件の違いがあり、ほぼ一からの検討となった。結果として、可用性画分からの精製が可能で、収量も期待出来ることが判明した。一方で、精製度合を何処まで上げるか、と発現用タグを切り離した際の実際のプロテアーゼ活性の確認は、次年度の課題として残された。研究２）に関しては、SAm2の人工遺伝子合成から検討し、当初hCBD-SAm2の大腸菌での発現量が僅かであったため、SAm2に該当する塩基配列を複数検討することとなった。予想よりも難航する可能性が危惧されたため、次年度の計画を一部前倒しして、hCBDを介して抗体をセルロース基材へ吸着・利用する課題検討を併行して開始した。最終目標は、市販のIgG抗体を広く利用可能な基盤技術開発であるが、差し当たり、特定の抗原に対する抗体分子を直接hCBDに融合利用する検討を進めた。抗体としては、ラクダ抗体に由来するナノボディで、緑色蛍光蛋白質・GFPに特異結合してGFPの蛍光輝度を上げる抗体を試した。予想以上に順調であり、当該抗体／濾紙ハイブリッドを乾燥保存させた後にも抗体活性が十分維持されることを確認した。
今後の研究の推進方策	SA派生体に関しては、複数の人工合成遺伝子を得ているので、これらを用いて発現量の増加を達成できるか、を検討するが、課題解決が容易でないと判断されれば、当該アプローチは保留する。一方で、本年度、蛋白質データベース（PDB）情報に基づく精巧な模型を3Dプリンターで造型し、これらの模型に基づいて融合蛋白質を設計する独自手法を会得した。３D模型に基づき、市販のIgGを汎用利用可能にする、抗体結合アダプターとしての人工蛋白質を既に考案している。既存ナノボディーの応用事例を増やすと共に、動物種、或いはIgGのサブタイプを越えて、汎用利用可能な抗体結合アダプターを新たに開発し、hCBDと融合させることにより、紙に任意の市販IgG抗体を吸着させる技術開発を進める。尚、当該技術に関して、年度内の早い内に特許出願を達成する。ペプチドタグ付きの組み替え蛋白質を特異的に捕捉する技術開発が本研究の１つの目的であり、当該アプローチが成功すれば、SA派生体のアプローチは、必ずしも必須ではなくなるため、保留から中止という展開も起こり得ると考えられる。また、加温振盪条件下での繊維脱離の少ない素材を特定できたので、これを用いて既存のHRV-3Cプロテアーゼ検出系の性能を改めて評価する。また、SARS 3CL プロテアーゼR188I変異体の大腸菌での発現と精製条件を整えつつあるので、プロテアーゼ活性の確認と評価を進めると共に、HRV-3CをSARS-3CLに置き換えた検出系の作製を検討する。SARSコロナウィルスは、世界的に見て、重大な感染症の原因ウィルスであり、早期の検査システムが望まれる。これについても、知財出願を急ぎ、また学術論文としての成果発信を目指す。