| 研究課題/領域番号 |
16K07861
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| 研究機関 | 国立研究開発法人水産研究・教育機構 |
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研究代表者 |
名古屋 博之 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, 主幹研究員 (40372031)
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| 研究分担者 |
森 司 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (60241379)
正岡 哲治 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, 主任研究員 (70372042)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 遺伝子組換え魚類 / アマゴ / 成長ホルモン遺伝子 / 高成長 / タンパク質 / 網羅的解析 / エピジェネシス |
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| 研究実績の概要 |
既存の遺伝子組換えアマゴ(以下、GHアマゴ)はベクター領域も一緒に挿入されている。継代するにつれ成長促進効果や生物学的特性等の差が小さくなりつつある。これらの原因を解明するためタンパク質レベルの変化の解明とベクター領域の影響を除くためプロモーターとGH領域のみをマイクロインジェクションした個体(新規GHアマゴ)作出を試みた。新規GHアマゴ作出のため、7組の交配区、計847粒の受精卵に0.5～2μl（15～100ng）マイクロインジェクションした。ふ化率は対照区が87.4～99.4％（平均95.9％）であったのに対し、実験区では5.4～66.8％(平均46.6％）と低かったが、その後の生存率は対照区と同等であった。次に、既存GHアマゴにおいて、顕著な形態差を示している肝臓を用いてタンパク質発現を調べた。最初にSDS-PAGE法を用いてタンパク質を分離し、発現量を比較した。250、150及び100KDa付近で発現差を確認し、液体クロマトグラフ質量分析法によってタンパク質を同定した結果、250KDa付近のタンパク質はアセチルCoAカルボキシラーゼ、150KDa付近はピルビン酸カルボキシラーゼ、100KDa付近はαーアクチニン酸で、脂肪酸合成とエネルギー代謝に関連する酵素に発現差があった。さらに、iTRAQ法によって肝臓タンパク質の発現を網羅的に解析した結果、脂質関連酵素の⊿-9デサチュラーゼ、APMAPが減少し、Fatty acid binding protein、ApolipoproteinA-1、電子伝達系酵素のNADH-ubiquinone oxidoreductase、ATP synthase、CoxⅡ、Ⅲ、Ⅳで増加した。また導入遺伝子ホモ個体で、血管拡張関連タンパク質の血管拡張を促すタンパク質と炎症系マーカータンパク質の炎症マーカーが増加し、炎症抑制マーカーが減少した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
新規成長ホルモン遺伝子組換えアマゴの作出に関してはふ化、生存している個体約300尾のうち、半分の168尾の脂鰭からゲノムDNAを抽出して導入遺伝子の確認を行っているが、導入遺伝子は認められていない。これはマイクロインジェクションした個体は染色体に組み込まれた時期によって全ての組織に組み込まれるわけで無く、脂鰭で確認されなかったからといって次世代に組換魚類が得られないということではない。次世代が取れるまで、このまま飼育を続け、次世代で導入遺伝子を確認する。また、成長ホルモン遺伝子を導入のほとんどの個体はスモルト化してしまう。対照区はスモルト化していないので、スモルト化による変化と遺伝子を導入したことによる変化を確認する必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
事前研究でベクター領域の影響も考えられたため、ベクター領域の無い成長ホルモン遺伝子だけを導入した組換え魚類を用いて比較をしたい。そのために新規に作出している成長ホルモン遺伝子導入組換えアマゴの作出に成功したい。また、導入遺伝子が染色体上に対に入っているホモ個体、片方の染色体上だけに入っているヘテロ個体と対照区で発現等に差がありそうなので、事前にホモ個体とヘテロ個体を分けて生産する必要がある。最後に対照区がスモルト化していないので、スモルト化していない成長ホルモン遺伝子組換えアマゴを比較したいが、飼育施設の関係でスモルト化しやすい水槽になっているため、飼育している中からスモルト化していない個体を見つけ、次世代を作出することが重要である。
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