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2016 年度 実施状況報告書

アルカリ化酵母とその酵素系による強酸性水圏中和の分子機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号 16K07868
研究機関東京海洋大学

研究代表者

浦野 直人  東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (90262336)

研究分担者 岡井 公彦  東京海洋大学, 学術研究院, 助教 (00596562)
石田 真巳  東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (80223006)
研究期間 (年度) 2016-04-01 – 2019-03-31
キーワード酵母 / 強酸性水圏 / 中性水圏 / 中和能 / アルカリ化酵母 / 酵素 / 生態系
研究実績の概要

強酸性水圏(pH1~4)から発見して単離したアルカリ化酵母の更なる生態解明を行うために、一般の中性水圏(pH6.4~7.8)からのアルカリ化酵母の単離を試みた。横浜市の淡水圏-池や用水路の表層水・底層水などを中心に単離した。
アルカリ化酵母の菌種同定を行ったところ、Aureobasidium pullulans, Auriculibuller sp., Bullera alba, Candida parapsilosis, Candida oleophila, Candida cyclindracea, Candida sp., Crpptococcus sp., Cryputococcus flavescens, Filobasidium magnum, Hannaella pagnoccae, Meyerozyma guilliermondii, Pseudozoyma antarctica, Pseudozyma tsukubaensis, Papiliotrema flavescens, Rhodotorula sp., Leucosporidium golubeviiなど13属21種もの酵母種が発見された。
強酸性水圏での先行研究と比べて、一般水圏では多様性が高いことがわかった。また、群馬県吾妻川や秋田県田沢湖などの強酸性水圏から単離した酵母と同一種の酵母も発見された。
これらの結果から、酵母のアルカリ化能は、特定の酵母種が持つ一般的な性質であり、中性環境では発現しないが、酸性環境に置かれると発現する性質である可能性が高いと考えられた。
アルカリ化酵母の中和活性を持つ酵素系の単離を目指して、培養酵母細胞を破壊して、遠心後の沈殿物と上清を回収した。これらからはカザミノ酸を分解して、アンモニウムイオンを生成する酵素活性を得られなかった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

アルカリ化酵母の生態系を解明する研究は非常に順調に進展した。中性水圏にもアルカリ化酵母が、多種多様に生息していることがわかった。生態系の解明研究は予想以上に進展した。
一方、アルカリ化酵母が保持する酵素系:酸性水を中和する活性を持つ酵素は単離することができなかった。当初の予想では酵素系は単一の酵素(アンモニウムリアーゼ)である可能性が高いと考えたが、複合酵素系であり、酵母細胞の破壊により酵素系が失活する可能性も示唆された。
現在は対応策を検討中である。

今後の研究の推進方策

アルカリ化酵母の生態系解明研究では、中性淡水圏にて多種多様のアルカリ化酵母が発見され、強酸性水圏のそれとほぼ同等の中和活性を持つことがわかった。今後は中性海水圏におけるアルカリ化酵母を探索する。
アルカリ化酵母が持つ酵素系の分子解析研究では、酵母細胞破壊液の蛋白質電気泳動を行ったところ、酸性環境で培養した酵母と中性環境で培養した酵母で、電気泳動のバンドに差があることがわかった。現在、異なった蛋白質バンドの解析を行っている。
今後はアルカリ化酵母のpH培養条件により異なった発現をする蛋白質の差から、中和関連酵素系を追跡していく計画である。

次年度使用額が生じた理由

28年度では、計画にあった中和活性酵素(アンモニウムイオン生成酵素)を単離することができなかった。これは酵素が当初の推測と異なり、複合酵素系である可能性が高く、酵母細胞の破壊により、酵素系の一部が失活している可能性が高くなった。研究の進展が遅れたため、研究の一部を29年度に回すことにした。
そこで29年度は、酵素系の解析を酵素活性から追跡するの代替として、菌体抽出蛋白質の電気泳動差から、解析することに研究方針を変更した。

次年度使用額の使用計画

29年度は、アルカリ化酵母を酸性下と中性下で培養する。酵母菌体を破壊して蛋白質を抽出する。抽出液を電気泳動(1次元または2次元)する。酸性条件と中性条件で、異なった特定蛋白質を分離する。特定蛋白質のアミノ酸配列を決定して、蛋白質種を分類同定する。
蛋白質種から、中和活性酵素(アンモニウムイオン生成酵素)系を推測する。酵素系の遺伝子をクローニングする。
主に、上記の研究に使用する予定である。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2017 2016

すべて 雑誌論文 (2件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (2件)

  • [雑誌論文] Isolation of aquatic yeasts with the ability to neutralize acidic media, from an extremely acidic river near Japan's Kusatsu-Shirane Volacano2017

    • 著者名/発表者名
      Daisuke Mitsuya, Takuya Hayashi, Yu Wang, Mami Tanaka, Masahiko Okai, Masami Ishida, and Naoto Urano
    • 雑誌名

      Journal of Bioscience and Bioengineering

      巻: 124(1) ページ: 43-46

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] 水圏に生息する天然酵母の単離と有効利用2016

    • 著者名/発表者名
      浦野直人、三矢太亮、岡井公彦
    • 雑誌名

      生物工学会誌

      巻: 第6号 ページ: 319-323

    • オープンアクセス
  • [学会発表] 強酸性水圏由来微生物に関する研究9:アルカリ化酵母・酵素による酸性水中和機構の解明2016

    • 著者名/発表者名
      長岡真太郎、梶原優子、岡井公彦、石田真巳、浦野直人
    • 学会等名
      平成28年度日本水産学会秋季大会
    • 発表場所
      近畿大学農学部奈良キャンパス
    • 年月日
      2016-09-09 – 2016-09-09
  • [学会発表] 強酸性水圏由来微生物に関する研究10:アルカリ化酵母・酵素バイオリアクターによる強酸性水の中和システムも構築2016

    • 著者名/発表者名
      梶原優子、長岡真太郎、岡井公彦、石田真巳、浦野直人
    • 学会等名
      平成28年度日本水産学会秋季大会
    • 発表場所
      近畿大学農学部奈良キャンパス
    • 年月日
      2016-09-09 – 2016-09-09

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公開日: 2018-01-16  

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