| 研究課題/領域番号 |
16K07870
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| 研究機関 | 東京海洋大学 |
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研究代表者 |
石田 真巳 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (80223006)
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| 研究分担者 |
岡井 公彦 東京海洋大学, 学術研究院, 助教 (00596562)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | リパーゼ / 高圧適応 / バイオサーファクタント / 遺伝子分布 / Moritella属 |
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| 研究実績の概要 |
2018年度は前年度から継続して、海洋好冷菌Maritella sp. F1株およびF3株の全ゲノム解析を完了した。Lip-IIリパーゼ遺伝子の比較を行った結果、Lip-II遺伝子は両株ゲノム上に1個ずつ存在し、コードするアミノ酸配列は完全に一致することが分かった。従って、両株Lip-IIの圧力特性の違いは、アミノ酸配列の違いによるのではない。
そこで、Lip-IIリパーゼの圧力特性に影響する他の因子を探した。先ず、両株のゲノム上の脂質分解に関連する他の遺伝子の個数や配列を比較したが違いはなかった。次に、脂質存在下で両株を培養して違いを観察した。その結果、F3株のみがLip-IIと共に白濁物質を生産し、多量のバイオサーファクタントである可能性を発見した。そこで、両株を脂質存在下で培養しながら乳化活性とリパーゼ活性を追跡した。培養開始後24時間からF3株のみで酵素活性と乳化活性が顕著に上昇し、27時間で培養液が白濁した。F1株では、24時間後からリパーゼ活性だけが上昇し、乳化活性は殆ど上昇しなかった。この結果から、F3株のみが多量に生産した白濁物質はバイオサーファクタントであり、Lip-IIの活性にバイオサーファクタントが影響すると考えられた。従来、Moritella属細菌がバイオサーファクタントを生産するという報告はない。
昨年度、高発現化したF1株のLip-IIについては、結晶化に向けてスケールアップ培養で酵素の増産を試みたが、必要なタンパク質量には足りず、立体構造解析は中断することとなった。また、F1株とF3株に存在するLip-IIとLip-Iの遺伝子対の分布を相同性検索し、Moritella属とPsychromonas属に相同性80%以上の遺伝子対があるのに加え、Pseudoalteromonas等の広範な細菌に相同性40％程度で遺伝子対が存在することが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の当初の目的は、海洋好冷菌Moritella sp. F1株とF3株の新規リパーゼであるLip-IIがF1株の酵素は好圧性、F3株の酵素は非好圧性であることに基づき、両株の酵素の構造機能相関を分析し、未だ報告のない好圧性の分子メカニズムを解明することであった。そのために、両株酵素のアミノ酸配列や立体構造を分析し、違いを浮き彫りにすることを目指した。立体構造は当初の計画より高発現化が難しく、2018年度までに完了しなかった。一方、アミノ酸配列については全ゲノム解析を行って2018年度に比較を完了した。その結果は予想外で、Lip-IIのアミノ酸配列には株間の違いがなく、好圧性の違いは別の因子によると分かった。この別の因子を探し、リパーゼの脂質分解を補助するバイオサーファクタントをF3株のみが多量に生産していることを発見し、酵素の圧力特性にバイオサーファクタントが影響すると推定した。また、これまでリパーゼの圧力特性以外の違いが殆どなかったF1株とF3株に、バイオサーファクタントを多量に生産するか否かという顕著な違いがあることが明確になり、別々の株として報告する価値が高くなった。
以上のように、2018年度は、F1株とF3株の全ゲノム解析を達成して両株酵素のアミノ酸配列が一致するという予想外の結果を得、F3株だけが多量に生産するバイオサーファクタントが酵素活性に影響すると推定するに至った。従来、酵素以外の分子が酵素の圧力特性に影響すると予想した報告はない。
2018年度をまとめると、目的の一つだった立体構造解析が達成できなかったが、酵素の圧力特性に酵素以外の分子が影響する可能性を発見し、予想外の大きな前進があった。2018年度までの進捗状況として、未達成の項目があるが、達成して新たな発見につながった項目もあるので、(2)概ね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度（2019年3月）に、本研究課題の1年間の期間延長を認めて頂いた。延長された2019年度は、リパーゼの圧力特性に対するバイオサーファクタントの影響の追試を行う。即ち、F3株由来のバイオサーファクタントを添加するとF1株のLip-IIリパーゼの圧力特性が変化するかを確認し、両株酵素の圧力特性の違いがバイオサーファクタントの違いによることを確認する。
2019年度は、本研究課題の最終年度なので研究成果全体を総括し、公表する。バイオサーファクタント関係の新たな結果は学会発表を行う。そして、研究成果の全体をいくつかの論文にまとめ、学術雑誌に投稿する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2018年度は当初の計画と異なる結果の展開があった。即ち、当初は異なると想定していたF1株とF3株のリパーゼのアミノ酸配列が全ゲノム解析によって一致していることが分かった。そのため、新たな展開として、バイオサーファクタントの生産が株間で異なるという新発見につながり、酵素の圧力特性とバイオサーファクタントの関係が重要であるとの判断になった。これらの結果を含めて学会発表し、また学術論文として投稿することが2018年度中には間に合わなかった。そのため、バイオサーファクタント関係の一部追試の実施費用を含めて、学会発表や論文投稿の費用を次年度（2019年度）に使用することにした。
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