研究課題
リソソームは細胞内にて異化分解を行うオルガネラであり、近年ではオートファジーの最終到達地点としてその機能が注目されている。哺乳類ではNeu1シアリダーゼが種々の疾病（シアリドーシスや癌）、神経細胞の分化、免疫などに関与していることが分かってきたが、魚類においてはその機能については全く報告が得られていない。哺乳類Neu1の機能から魚類においても発生や分化、感染などにNeu1が関与していることが強く予想されている。そこで本研究では、魚類リソソームにおけるNeu1シアリダーゼの機能を明らかにするため、ゲノム編集技術によるNeu1ノックアウトメダカを作製し解析を行うことを目的とした。メダカゲノム情報を元にsgRNA配列を数種類設計し、メダカ受精卵へのマイクロインジェクションを行った。その結果、孵化率の著しい低下が認められたため、Neu1の胚発生への影響が示唆された。そこでNeu1ゲノムには影響を与えず、一過性のタンパク質翻訳阻害が可能であるモルフォリノオリゴを用い、メダカ受精卵へのマイクロインジェクションを行った。Neu1-MOはNeu1ノックダウンと同様にメダカ孵化率の低下を引き起こし、胚の吸収阻害や心拍数の上昇などの表現型が確認された。そこで糖タンパクの組成を解析したところ、Neu1-MOメダカにおいて卵黄タンパク質由来と思われるシアロ糖タンパク質の異常蓄積が認められた。この結果から、Neu1は胚発生に重要な因子であることが明らかとなり、養殖業においてNeu1遺伝子の発現が種々のバイオマーカーとしての応用が期待される。
2: おおむね順調に進展している
Neu1遺伝子をノックアウトするためのsgRNAの設計は、メダカゲノムブラウザーを用いて行った。開始コドン周辺のPAM配列を数種類選び出し、標的配列を含むオリゴDNAをDR274プラスミドにサブクローニング後、in vitro転写システムによりsgRNAを合成した。その切断効率を確認するため、標的配列を含むゲノム領域をPCRにより増幅し、rCas9/sgRNAと反応させた。その結果、いくつかのrCas9/sgRNAでin vitroでのDNA切断が認められた。そこでこのsgRNAとCas9 mRNAを1細胞期のメダカ受精卵にマイクロインジェクションして、ノックダウンメダカの作製を試みた。ところが、このsgRNAをインジェクションした個体では発生が途中で停止するものが多く、孵化率が著しく低下した。ヒトNEU1遺伝子の欠損症は重篤な発生異常を示すことから、魚類Neu1の遺伝子ノックアウトはこれと同様に発生に影響していることが強く示唆された。そこでNeu1タンパク質翻訳を阻害するモルフォリノオリゴ（MO)を設計し、メダカ受精卵へのマイクロインジェクションを行った。これはMOによる翻訳阻害は一時的であり、ゲノム配列には影響を与えないことから、Neu1ノックダウンによる機能解析が有効であると考えたからである。Neu1-MOメダカでは対照MOと比べて胚のサイズが小さく、卵黄の大きさが有意に大きく観察された。またNeu1-MOでは孵化率の低下や心拍数の上昇が認められ、胚発生に異常があることが明らかとなった。そこでシアロ糖タンパクの組成についてレクチンブロットで解析したところ、α2-3シアル酸結合を持つ糖タンパク質がNeu1-MOで異常蓄積することが明らかとなった。この結果から、Neu1が卵黄タンパクの分解を通じて胚発生に重要な因子であることがin vivoで明らかとなった。
平成28年度の研究成果により、魚類Neu1シアリダーゼが胚発生に重要な因子であることが明らかとなった一方で、Neu1遺伝子を完全にノックアウトしてしまうと孵化率が低下し、KOメダカの作出が難しいことが予想された。そこで平成29年度では、Neu1の遺伝子を完全に破壊するのではなく、Neu1の酵素活性が一部低下したメダカを作出することを目的として、引き続きsgRNAによるゲノム編集を行う。魚類Neu1の点変異によるシアリダーゼ活性低下については全く報告が無いが、魚類Neu1の機能はヒトNEU1と高度に保存されていることが我々の先の研究で明らかになっているため（Ryuzono et al., 2016 Gene)、ヒトシアリドーシスにて報告されているNEU1の点変異を参考にしてsgRNAの設計を行う。また魚類Neu1の活性化に重要であるCathepsin Aのノックアウトについても検討する。これはNeu1シアリダーゼのリソソーム局在と安定化にはCathepsin Aが必要であり、ヒトにおいてCathepsin A不全がシアリダーゼ活性の低下を生じさせることが報告されているからである。これらの方法により作成したNeu1遺伝子改変メダカを用いて、バクテリア感染や成長における魚類Neu1の機能について解析を行う。また、このsgRNAを用いて培養細胞を同様にゲノム編集できることが期待できるため、in vitroにおけるNeu1の機能解析についても同様に行う。必要の応じて、Neu1と同様にリソソームに局在することが予想されるメダカNeu4についても、遺伝子ノックアウトもしくはモルフォリノオリゴによる遺伝子改変を検討する予定である。
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Biochimie
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Fish Shellfish Immunol
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