| 研究課題/領域番号 |
16K08036
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| 研究機関 | 京都産業大学 |
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研究代表者 |
前田 秋彦 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (70333359)
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| 研究期間 (年度) |
2016-10-21 – 2019-03-31
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| キーワード | トゴトウイルス / ミニゲノム / リバースジェネティックス / 病原性解析 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は、ヒトのRNAポリメラーゼⅠ(PolⅠ)プロモーターの下流に、トゴトウイルス（THOV）の感染細胞で複製が可能なRNAであるTHOVミニゲノム（ウイルスの3’末端非翻訳領域－レポーター遺伝子（赤色蛍光蛋白質（DsRed2）と分泌型ルシフェラーゼ遺伝子（Luc））－5’末端非翻訳領域の順に配置したRNA）の発現ベクター（pHH21-NP DsRed2およびpHH21-NP Luc）の発現解析を行った。これらのプラスミドを、ヒト由来のHeLa-21細胞に導入した後、THOVを感染することによりウイルスRNAポリメラーゼを付与した。その結果、レポーター遺伝子の発現は確認されたが、その発現量は低かった（生細胞の顕微鏡観察における観察では、DsRed2の発現は観察されなかったが、DsRed2の免疫染色により発現が観察された）。この原因は、ヒトの細胞へのTHOVの感染・増殖が低いためではないかと考えられた。そこで、THOV感染に高い感受性を示す細胞を調べたところ、ハムスターの細胞（CHO-K1やBHK-21細胞）がTHOVの増殖を強くサポートしていることが明らかとなった。また、様々な力価（最低１プラーク形成単位（plaque forming units (p.f.u.））のTHOVをハムスターの腹腔内に接種した場合、全ての個体が接種後3～４日で斃死した。これらの結果は、ハムスターおよびハムスター由来の細胞がTHOVに高感受性であることを示している。そこで、pHH21-NP DsRed2のヒトPolⅠプロモーターをハムスターのPolⅠプロモーターに置換したTHOVミニゲノム発現プラスミド、pHH21-htoH-NP DsRed2を作製し、ハムスター細胞でのTHOVミニゲノムの発現について検討したところ、レポーター蛋白質のDsRed2蛋白質が高発現していることが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度の当初の予定では、開発したin vitroのミニゲノム発現系を用いて、ミニゲノムの複製・翻訳を定量的に解析するはずであった。昨年度の時点で、ヒトのPol Ⅰプロモーターを用いたミニゲノム発現系については確立していた。しかし、レポーター蛋白質の発現レベルが低く、ミニゲノム発現の定量的変化を解析できるレベルではなかった。そこで、本年度、その改良型としてハムスターのPol Ⅰプロモーターを用いたTHOVミニゲノム発現系を構築した。ハムスター由来のCHO-K1細胞やBHK-21細胞におけるTHOVのウイルス産生量は、HeLa細胞などのヒト由来のものに比べ100倍以上高かったこと、また、ハムスターへの腹腔内接種による病原性が非常に強かったことから、ハムスターのPolⅠプロモーターを用いたミニゲノム発現系は有効であることが予想された。実際、CHO-K1細胞からハムスターのPolⅠプロモーターを抽出し、このプロモーターを用いて作製したDsRed2をレポーターとするTHOVミニゲノム発現系は効率が良かった。THOVミニゲノム発現系の発現効率の問題が解決したため、レポーター遺伝子を分泌型のLucに置換し、THOVミニゲノム発現を定量化できるものと考えられる。また、本年度中に、THOVミニゲノム発現系を応用した組換えTHOVの作製系について検討することを計画していた。THOVはマイナス鎖RNAをゲノムとするため、組換え体の作製時にウイルスRNAの合成に必要なウイルス蛋白質を発現させる必要がある。現在、ウイルス蛋白質のCAGプロモーターを用いた発現系について検討中である。以上のことから、本年度の研究進捗状況を、「(3)やや遅れている」とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度は、まず、細胞系におけるTHOVミニゲノム発現の定量化を行う。これまでの研究で作製した分泌型ルシフェラーゼ発現THOVミニゲノム発現ベクター、pHH21-htoH-NP Lucをハムスターに由来する細胞（CHO-K1やBHK-21細胞）に導入し、THOVを感染させる。レポーター蛋白質である分泌型ルシフェラーゼは培養上清中に分泌されるため、継時的なTHOVミニゲノムの発現を解析できる。このTHOVミニゲノム発現系を確立した後、発現プラスミドに組み込まれているTHOVの5’および3’末端非翻訳配列のTHOVの複製に関与する領域をマッピングする。次に、ミニゲノムの複製をTHOVの非感染下で行うため、THOVの複製に必要なウイルスのポリメラーゼ蛋白質（PB2、PB1およびPA）とヌクレオプロテイン（NP）の発現プラスミドを作製する。これらの発現プラスミドは哺乳類細胞での高発現が期待されるプラスミド、pCAG GSに組み込む。作製したプラスミドを、THOVミニゲノム発現プラスミドとともに、ハムスター由来の細胞やヒト由来細胞に導入し、THOVミニゲノムの発現解析を行う。最終的に組換えTHOVの作製のために、６分節すべてのTHOVゲノムRNA発現プラスミドを作製し、ウイルスのポリメラーゼ蛋白質とNP発現プラスミドと同時に細胞に導入する。このようにして得られた組換えウイルスの病原学的特徴や生物学的特徴を、親ウイルスと比較解析する。本研究で得られた成果については適宜、関連学会に報告するとともに、学術誌上に発表する。また、平成30年度は、本研究の最終年度であるので、研究を総括する。
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