| 研究課題/領域番号 |
16K08042
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
加来 義浩 国立感染症研究所, 獣医科学部, 主任研究官 (70392321)
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| 研究分担者 |
浅井 知浩 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (00381731)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 狂犬病 / 治療 / DDS / ナノ粒子 |
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| 研究実績の概要 |
狂犬病は、狂犬病ウイルス（Rabies virus: RABV）を原因とする人獣共通感染症である。ひとたび発症すると確実な治療法はなく、致死率はほぼ100%である。本研究は、RABVに対する人工小型抗体（single chain variable fragment: scFv）をRABV感染細胞に導入して、RABVの増殖を阻害することにより、狂犬病の治療法への応用を目指す。
当初の計画では、ナノ粒子を血中に投与し、血液脳関門（BBB）を通過させて脳実質へ送達することを目的とし、BBB透過性分子とRABV感染細胞特異マーカーで修飾したナノ粒子の開発を目指していた。しかし近年、経鼻接種により、薬剤を脳実質へ送達する技術が報告され、DDS研究において進展が期待される分野のひとつになっている。経鼻接種による脳内への薬物移行メカニズムは完全に明らかにされていないものの、血中投与より低い侵襲性で効果が期待できることから、本研究においても経鼻接種を前提にナノ粒子の開発を進めることとした。今年度は、ナノ粒子による抗RABV-P scFv遺伝子の導入効率および細胞毒性を評価するため、組成の異なる2種類のリポソーム（①、②）を作製した。混合脂質として、①では dicetylphosphate-diethylenetriamine誘導体/コレステロール/ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（混合比：1/1/1）、②ではdioleylphosphate-diethylenetriamine誘導体/コレステロール/ジパルミトイルホスファチジルコリン（同：2/2/1）を使用した。①、②のいずれにおいても、市販のtransfection試薬に比べ、in vitroにおける導入効率は劣るものの、細胞毒性の大幅な低減が確認できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度は複数の組成のリポソームを用いて、in vitroにおけるscFv遺伝子の導入効率および細胞毒性を評価した。DNAとリポソームの混合比を複数検討し、最適な導入条件を確定した。対照においた市販のtransfection試薬と比較したところ、in vitroにおける導入効率は市販薬よりも劣るものの、同量の市販薬を用いた場合よりも細胞毒性は大幅に低減することを確認した。このことから、将来的な臨床応用に向けた課題のひとつであったin vivoにおける安全性も担保できると考えられる。
一方、scFvを中枢神経系のRABV感染細胞特異的に発現させるピンポイントDDSの分子的基盤となる「RABV感染細胞特異マーカー結合分子」については、複数の候補について研究を進めているものの、まだ確定するに至っていない。また導入されるscFv遺伝子そのものについても、導入／発現効率のさらなる向上を目指す余地があると考えられる。これらから、進捗状況を「やや遅れている」とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
抗RABV scFvを中枢神経系のRABV感染細胞特異的に発現させるピンポイントDDSの構築を目指し、その分子的基盤となる「RABV感染細胞特異マーカー結合分子」として、抗RABV-G scFvとともに、RABVに対する宿主側レセプター蛋白質等の利用の可能性を検討する。これらの分子をナノ粒子あるいはウイルスベクターの表面に外套させ、RABV感染細胞特異的な吸着およびエントリーが可能かどうかを検証する。scFv遺伝子については、in vitro実験（マウス神経芽腫由来MNA細胞を使用）およびin vivo実験（マウスを使用）における遺伝子導入／発現効率の向上を目指し、マウスに合わせたコドン最適化を行うとともに、他のプラスミドの利用を検討する。これらを組み合わせてナノ粒子を作製し、in vitro／in vivoにおける実験に利用する。具体的には、まずRABV感染／非感染MNA細胞に接種し、scFvの発現状況、RABVの増殖阻害効果を検証する。その結果をふまえ、RABV感染／非感染マウスにナノ粒子の経鼻接種を行い、scFvの発現状況、RABVの増殖阻害効果およびマウスの生存日数への影響を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画では、ナノ粒子の血中投与を目的として、今年度「BBB透過性分子」および「RABV感染細胞特異マーカー結合分子」を外套したナノ粒子を作製する予定であった。しかし上述のとおり、「RABV感染細胞特異マーカー結合分子」の探索が継続中であるとともに、投与経路を経鼻接種に変更したことにより、今年度は外套分子を持たないナノ粒子のみの作製となった。これにより、当初計画していたナノ粒子合成費用のうち、分子の外套に必要な材料の購入を行わなかったことから、次年度使用額が生じた。
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