血漿中遺伝子の網羅的解析による犬の新規ウイルスの検索

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K08057
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 桃井 康行 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 教授 (40303515)
• 研究分担者: 松鵜 彩 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 准教授 (40348595) ; 前田 健 山口大学, 共同獣医学部, 教授 (90284273)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: 犬 / ウイルス / 次世代シーケンス

研究実績の概要

すでに悪性リンパ腫や原因不明リンパ節炎の症例から採取した検体を材料にRNAの網羅的解析を行っている。また不明熱や肝炎の症例から採取した血漿を材料に血漿中に存在するRNAを増幅しRNA次世代シーケンスを行っている。得られた次世代シーケンスの塩基配列から犬のゲノムにマッピングされない配列を集め、新規のウイルス配列をBLAST検索によりウイルスデータベースに参照した。その結果、レトロウイルス様配列、牛伝染性下痢ウイルス、ポックスウイルスに類似した配列が検出された。しかしその後の詳細な解析では、それらのウイルス様配列は、実際にはイヌゲノム由来であることが判明した。これまでのところ不明熱や肝炎の症例からウイルス様配列は取得されていないが、いくつかの興味深い知見が得られた。すなわちイヌゲノム中にはウイルス様配列が多数存在すること、それらの配列が実際にRNAとして転写されかなりの量が血中に流れていることが示唆された。特に牛のウイルスと遺伝学的にかなり近い配列が犬で転写されていることはウイルスの共進化を考える上で非常に興味深い結果であった。
また次世代シーケンスによる解析を行う前に、既知の感染症を除外するため細菌、真菌、抗酸菌のそれぞれに特異的プライマーを用いた解析をいくつかの症例で行った。その塩基配列の解析結果から、不明熱の１症例からこれまで国内で報告のない真菌遺伝子が検出された。この真菌は組織においてもその存在が示唆されこの症例の病原体となっていることが示唆された。さらに別の症例からは抗酸菌であるロドコッカス遺伝子が増幅された。この症例ではリンパ節にもわずかに抗酸菌に矛盾しない病原体が観察されており、有効な抗菌薬により一時的な改善が得られている。現在、経過を観察しつつ解析を行っている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

不明熱と原因不明の肝障害の症例を中心に解析を次世代シーケンスの解析を行ってきた。所得したショートリード配列を犬にマッピングし、マッピングされない配列について解析をおこなっているが、犬の血漿中には予想以上にウイルス様配列が存在することがわかった。その中には伝染性下痢やpoxウイルスやレトロウイルスに類似したものが多くみられるが、詳細な解析によりイヌゲノム由来であることが判明し、現在のところ新規のウイルスを疑わせるものはとれていない。これらウイルス様の配列の存在や宿主由来の血漿DNAの存在のするため、多くのリードを取得する必要があり、解析のコスト（次世代シーケンスの費用）が増大している。今後、新規のウイルス発見の確率を上げるためには、より多くの症例で解析をチャレンジしていくことが必要なことが判明した
今後は、宿主（犬）由来の遺伝子成分を減らす工夫（抽出方法など）を行ない、さらに1検体あたりのリード数をやや抑え、症例数を増やすことでウイルス検出の確率をあげていきたい。さらにこれまで得られた塩基情報（とくに内因性のウイルス様配列）を利用して、遺伝子情報解析処理のパイプラインを簡素化し、解析スピードを向上させたいと考えている。

今後の研究の推進方策

本年度は前年度に引き続き新規ウイルスを検出するため、不明熱や炎症マーカー高値の症例を中心に全血、血漿、リンパ節生検などの材料を採取する。採材した材料について適時、遺伝子抽出作業と解析を行い新規微生物の検出を次世代シーケンスにより行う。さらに未知の微生物について効率よく解析を行うため、細菌、真菌、抗酸菌、マイコプラズマなどについてもユニバーサルプライマーをプライマーを用いた病原体遺伝子の増幅と塩基配列決定による同定を行い、未知の病原体を検出するとともに、時間と費用のかかる次世代シーケンスを効率よく行えるようにする。本年度の研究推進計画については以下のとおりである。
桃井：臨床現場で感染症症例からの採材を続けるとともに、その材料からの病原体遺伝子の増幅や同定を続けていく。さらに効率よく症例を集めるため、一般の臨床獣医師に対しても不明熱の症例などを中心に検体の提供を呼びかける。
松鵜：鹿児島地域や離島の動物などからの採材とモニタリングを続ける。また昨年度は野鳥においてトリインフルエンザの発生が国内で多くみられた。その発生地域の猫等から血液等を採取し、国内でほとんど確認されていない伴侶動物へのインフルエンザの感染について感染歴を調査する。
前田：全国から新規感染症を疑う症例の検体を集め解析を進めるとともに桃井から提供された検体についてウイルスの分離、同定等を試みる。
次世代シーケンスなどで新規ウイルスなどを疑わせる配列が取得された場合には、培養細胞等を用いた病原体の単離を試み、増殖可能なウイルスについてはde novoの遺伝子配列マッピングによりウイルス全長の塩基配列の同定を行う。またその塩基情報をもとに蓄積したサンプルから特異的なPCRによる増幅により疫学調査を行う。

次年度使用額が生じた理由

これまでの次世代シーケンスの結果を解析したところ、本来の目的（ウイルス遺伝子）とは異なる宿主細胞由来の遺伝子が多く混入することが明らかになった。費用面での事情により本申請予算で次世代シーケンスを実施できる回数は制限されている。より有効に解析を行うため、手順の改善を行う必要が生じた。そのため、一旦、次世代シーケンスの外部委託を保留している。症例についても可能性の高い症例に絞り込む必要があり、次世代シーケンス前の感染症判定のスクリーニング検査を充実させた。その結果、次世代シーケンスに関連した使用額が減少し、スクリーニング検査を行う費用が増大し、結果として次年度への持ち越しが生じた。

次年度使用額の使用計画

今後、改善した方法で次世代シーケンスを行う予定である。持ち越し分の金額を含め、できるだけ効率よく、多くの症例で解析を進める予定である。