| 研究課題/領域番号 |
16K08078
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
五味 浩司 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (90293240)
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| 研究分担者 |
安井 禎 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (70434107)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 分泌顆粒 / 内分泌細胞 / トランスゴルジネットワーク / ペプチドホルモン / フォグリン / セクレトグラニン / SNAREタンパク質 / 遺伝子欠損マウス |
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| 研究実績の概要 |
1. 膵β細胞特異的フォグリン欠損マウス(PhbKO)において、その欠損がインスリン顆粒の密度低下やリソソームの形態変化を引き起こすのかについて解析した。我々の解析では、先行研究が示すドラスティックな形態異常（Diabetologia, 54:2347）とは異なっていた。より微細な形態変化を解析したところ、加齢個体で顆粒密度、ホルモン凝集物以外の物質を含む顆粒の割合および低電子密度顆粒内凝集物の蓄積頻度が低い傾向にあった。リソソームの数的変化やリポコンドリア形成は顕著な変化を示さなかった。本結果は、フォグリンの欠損が膵β細胞に及ぼす影響について、先行研究とは異なる興味深い所見である（発表準備中）。
2. 膵β細胞の分泌顆粒膜局在タンパク質の糖修飾と顆粒成熟度との関連性を調べるため、中性糖反応を用いた糖質局在を電顕解析した。その結果、PhbKOで分泌顆粒膜、リソソーム、ゴルジ装置などに陽性反応が検出され、ハローのある目玉状顆粒の顆粒膜よりも、非目玉状顆粒の顆粒膜で強い反応を示した。一方、反応陽性を示すリソソームの密度が高い傾向が認められ、そのサイズも大きい傾向であった。また、Sg3遺伝子欠損マウス（Sg3KO）では、分泌顆粒膜とその周囲に陽性反応を示す細胞が観察された。本結果は、フォグリンがリソソーム、Sg3が分泌顆粒の構造に関与することを示すとともに、分泌顆粒で陽性反応を示すものの顆粒成熟度を推測する上で、興味深い。
3. トランスゴルジネットワークを経由した分泌顆粒の誕生から成熟過に関わる分子機構について解析するための生化学的手法を検討した。細胞内小胞の膜融合に関わるSNAREタンパク質に注目し、特に、Syntaxin-6と複合体を形成するVAMPタンパク質について、組織解析が容易な外分泌組織を用い、内在性タンパク質を共免疫沈降法により解析する方法を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
1. PhbKOにおける膵β細胞のインスリン顆粒の微細形態に関わる解析はほぼ終了した。特に、先行研究との差異が明確となった。我々は、いくつかの微細な構造変化を明らかとし、先行研究の所見と関連する可能性のある点として、中性糖陽性反応を示すリソソームの密度上昇や大型化について示した。また、Sg3KOにおいて、分泌顆粒膜とその周囲および細胞質にやや強い陽性反応を示すことが観察された点は、Sg3が分泌顆粒の生成から成熟、老化などの過程に関わっていることを示唆する。
2. 分泌顆粒の誕生から成熟に関わる分子機構について、膜融合に関わるSNAREタンパク質の相互作用に注目し、外分泌組織を用いた内在性タンパク質の相互作用を検出する方法を確立した。特に、Syntaxin-6とVAMP4の相互作用は、各種分泌細胞に共通の分泌顆粒の成熟に関わる重要なマシナリーであると考えられる。
3. 亜鉛トランスポーター8の遺伝子欠損マウスを用いた解析は、海外からの導入を見送ったため、遂行できておらず、フォグリンおよびSg3両遺伝子欠損マウスを使用した解析をより深める研究計画を修正した。特に、Sg3の神経系細胞での発現に注目し、発現細胞種の同定と神経膠細胞における機能解析を進めている。Sg3KOはジーントラップ法によって作成されており、トラッピングベクターに挿入されたレポーター遺伝子（LacZ）の発現解析をタンパク発現と同時に行なっている。LacZの発現において、Sg3発現細胞（組織）での発現パターンと一致していることを確認した。また、発現細胞種の同定のため、Sg3のモノクローナル抗体の作成にも取り掛かっている。
4. PhbKOおよびSg3KOにおける内分泌組織の生化学的解析において、プロセッシング酵素や亜鉛トランスポーターなど分泌顆粒内タンパク質の解析が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. Sg3KOの内分泌組織において、形態免疫組織化学及びレクチン法により、電顕糖質化学解析を発展させる。膵β細胞内の細胞質中における陽性部位の割合で見られたわずかな差について、Sg3が細胞内の糖鎖修飾に何らかの影響を与えていることも考えられる。今後、検体数を増やすと共に、電顕レクチン法による特異的糖鎖解析を行うことで、Sg3と糖鎖修飾との関連性について精査する。
2. PhbKOおよびSg3KOの内分泌組織（膵島、下垂体、副腎）におけるプロセッシング酵素、亜鉛トランスポーターおよびカテプシンの発現変化について解析し、顆粒形成から分解系に至る過程における関与を明らかにする。また、光顕および電顕免疫組織化学法により、上記タンパク質の局在解析を行い、分泌顆粒のライフサイクルに変化がないかを調べる。
3. Sg3について、神経系細胞での発現に注目し、新たに作成したモノクローナル抗体を用いて神経-内分泌細胞を含む発現細胞種の同定と神経膠細胞における機能解析を進める。神経膠細胞における機能解析に関しては、これまでまったく不明である。培養細胞株であるラットグリオーマRGC-6とC6を用いて、各種刺激に伴う発現変化とプロセッシングパターンの変化を合わせて解析し、神経膠細胞におけるSg3の役割を明らかにする。
4. 亜鉛トランスポーター8の遺伝子欠損マウスについては、国内研究者へコンタクトをとり、研究上の使用制限に関して条件付きの分与を依頼するなどの対応によって、研究を進める。
5. 連携研究者である群馬大学鳥居博士と秋田県立大学穂坂博士の協力により、PhbKOおよびSg3KOの組織は十分に採材させていただける状況にあるので、下垂体、膵島、副腎といった内分泌組織を採材し、唾液腺組織で確立した共免疫沈降法による内在性SNAREタンパク質の相互作用について解析を進める。
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