| 研究課題/領域番号 |
16K08084
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
谷口 幸雄 京都大学, 農学研究科, 准教授 (10252496)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 希少動物の保全 / 遺伝的多様性 / トキ / マーカー型判定法 / 次世代シークエンサー / マルチプレックスPCR / SNP / マイクロサテライト |
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| 研究実績の概要 |
希少動物であるトキの保全においては、個体数の増加を図るとともに、集団の遺伝的多様性を把握し維持することが求められており、そのためには数百程度のDNA多型マーカーを簡便かつ低コストでタイピングする手法を確立する必要がある。我々は、日本トキ集団の始祖個体を対象に次世代シークエンサー(NGS)を利用した解析を実施し、5万を超えるDNA多型マーカー候補を検出している。本課題では、これらの候補から日本トキ集団において有効なマーカーを選抜するとともに、マルチプレックスPCRとNGSを用いた中規模のマーカー型判定法の開発を試みた。
トキ親子ペアのゲノムDNAサンプルの入手が遅れたため、計画の順序を変更し、まず、日本トキ集団の始祖5個体および後代20個体について、マルチプレックスPCR/NGS法による215マーカーのタイピングを実施した。タイピングデータの解析から、複数遺伝子座を増幅していると推定されたマーカーを削除し、172マーカーを有効なマーカーとして選抜した。
さらに、データベースに登録されているトキドラフトゲノム配列情報を利用し、マーカーのゲノム上での位置について検討した。近接したマーカーについて一方のマーカーを削除した結果、有効なマーカー数は151となった。これまでの解析結果からは、151マーカーを使用した場合でも、個体識別や親子鑑定は可能であると推察された。
しかし、トキ集団の遺伝的多様性の評価のためには、より多くのマーカーを利用することが望ましく、本実験計画では200程度を想定していることから、新たに110個のマーカー座位に対してPCRプライマーを作製した。各プライマーを個別にPCR増幅し、その評価を実施した結果、80プライマーをマーカー候補として選抜した。今後これらのマーカーを加えたタイピングを実施することで、中規模のマーカー型判定法を樹立する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
日本トキ集団の始祖5個体を含む25個体のゲノムDNAサンプルについて、215マーカーのジェノタイピングデータが得られた。これらのデータ解析およびトキドラフトゲノム配列情報を利用した近接マーカーの削除の結果、有効なマーカーとして151マーカーが選抜された。新たに、110のマーカー座位に対してPCRプライマーを設計し、その評価を実施した結果、増幅可能である80のプライマーが得られた。年度末までに、トキ親子ペア(父、母、子)のゲノムDNAサンプルも入手できており、これらのジェノタイピングデータを得るための準備も進められている。さらに、マルチプレックスPCRの反応条件の最適化に向けた検討についても準備が進められた。このように、研究はおおむね計画通りに進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
親子ペアおよび新たなトキ個体のゲノムDNAサンプルを使用して、マルチプレックスPCR/NGS法によるDNA多型マーカーのタイピングを実施し、有効なマーカーの選抜とマルチプレックスPCRの反応条件の最適化をさらに進め、中規模のマーカー型判定法を樹立する。
１）親子間でのアリル伝達様式の調査によるマーカーの有効性の評価
数ペアのトキ親子(父、母、子)を対象として、前年度に選抜した151のマーカーおよび追加した80のマーカーについてマーカー型判定を実施する。親子間での各マーカーアリルの伝達様式を調査し、遺伝様式に矛盾があるマーカーについては「真の多型マーカーではない」と判断してタイピングするマーカーから削除する。
２）新たなトキ個体でのタイピングデータの取得・解析と判定法の確立
さらに解析に用いるトキの個体数を増加し、選抜された多型マーカーのタイピングを実施する。得られたタイピングデータを解析し、マーカー間の連鎖について調査する。完全に連鎖したマーカーについては一方を削除するなど、さらにマーカーの選抜を進める。この選抜を終了した段階で、各マーカーから得られる塩基配列データ量が均一になるように、再度マルチプレックスPCRの反応条件の最適化を図り、中規模のマーカー型判定法を樹立する。
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