| 研究課題/領域番号 |
16K08085
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
三好 和睦 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 教授 (70363611)
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| 研究分担者 |
佐藤 正宏 鹿児島大学, 医用ミニブタ・先端医療開発研究センター, 教授 (30287099)
川口 博明 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 特任准教授 (60325777)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 体細胞核移植 / 疾患モデル動物 / マイクロミニピッグ |
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| 研究実績の概要 |
科学研究費助成事業（基盤研究（C））「世界最小サイズのミニブタであるマイクロミニピッグにおける体細胞核移植技術の確立」（平成25～27年度）において、体細胞クローンマイクロミニピッグ作出のドナー細胞として用いた胎児線維芽細胞由来株（FFs 1、2および3）におけるp53およびphosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10（PTEN）遺伝子のノックアウト（KO）を試みた。各細胞株にCas9 endonuclease発現ベクターおよびp53あるいはPTEN guide RNA発現ベクターをエレクトロポレーション法により供遺伝子導入した結果、体細胞クローンマイクロミニピッグを作出できたFFs 1および2を用いた場合には細胞株が得られなかったが、体細胞クローンマイクロミニピッグを作出できなかったFFs 3においては2株の細胞株が得られた。そのうちの1株（p53/PTEN#1）を分子生物学的に解析した結果、p53遺伝子に関してはホモKOであり、PTEN遺伝子に関してはホモKOとヘテロKOが共存している状態であることが示された。p53/PTEN#1を食用ブタの除核未受精卵に移植してクローン胚を作出し、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるバルプロ酸がそれらの体外発生に及ぼす影響について調べた結果、活性化後に8mMの濃度で24時間処理することにより胚盤胞形成率を改善し得ることが明らかになった。得られた胚盤胞におけるp53遺伝子の状態を分子生物学的に解析した結果、p53/PTEN#1で見られた変異がそのまま踏襲されていた。以上の結果から、p53およびPTEN遺伝子を欠損したマイクロミニピッグ体細胞クローン胚を効率的に作出し得る方法が確立された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予定通り、p53およびPTEN遺伝子を欠損したマイクロミニピッグ体細胞クローン胚を効率的に作出し得る方法が確立されたから。
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| 今後の研究の推進方策 |
p53/PTEN#1由来クローン胚を仮親に移植して、それらの体内発生能について調べる。しかしながら、FFs 3をドナー細胞として用いた場合には体細胞クローンマイクロミニピッグが得られなかったので、p53/PTEN#1由来クローン胚も産子にまで発生しない可能性がある。よって、体細胞クローンマイクロミニピッグの作出に成功したFFs 1や2由来クローン胚を作出し、前核形成期の細胞質にCRISPR/Cas9系 mRNAを顕微注入あるいはエレクトロポレーションで導入する遺伝子改変法の有用性についても検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
大学の業務と重なったので、予定していた学会への参加を取り止めたため。また、学生アルバイトを頼まなくても、充分な数の体細胞クローン胚を作出することができたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
体細胞クローン胚の仮親として使用するマイクロミニピッグの購入に充てることにより、移植実験の回数を増やしたい。
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