| 研究課題/領域番号 |
16K08093
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| 研究機関 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 |
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研究代表者 |
大石 勲 国立研究開発法人産業技術総合研究所, バイオメディカル研究部門, 主任研究員 (50314472)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ニワトリ / ノックイン / 抗体医薬 / 始原生殖細胞 / 組換え蛋白質生産 |
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| 研究実績の概要 |
鶏卵バイオリアクターを用いた安価な抗体医薬製造法の開発、検証を目指して抗体医薬（トラスツズマブ）遺伝子を卵白蛋白質オボアルブミンの遺伝子座にノックインしたニワトリの作製を試みた。オボアルブミン翻訳開始点より上流約2.8kb、下流約3.0kbの間に人工合成したトラスツズマブ遺伝子（重鎖および軽鎖から構成される）ならびに薬剤耐性遺伝子を挿入したドナーベクターを構築した。次にニワトリ始原生殖細胞株（雄型、ハイラインマリア種由来）に対しCRISPR/Cas9法によりオボムコイド翻訳開始点近傍を切断し同時に細胞に導入したドナーベクターのノックインを行った。薬剤耐性遺伝子で始原生殖細胞の選択を行った。細胞を一部回収し、ゲノムDNAを抽出した後にPCR法によって期待する遺伝子ノックイン細胞が取れているか検証を行い、ノックイン細胞が存在することを確認した上で生殖巣キメラヒヨコの樹立を行った。レシピエントとなる受精卵を4-6Gyのガンマ線照射によって内在性始原生殖細胞の大部分を不活化させた後に一胚当たり2000個以上の始原生殖細胞を移植した。移植は孵卵操作後2.5日、Hamburger and Hamilton（HH）stage13-15の間で行った。7羽の雄個体を孵化させ、性成熟に至るまで飼育を行った。キメラ個体より精液を採取し、ゲノムDNAを調整後、定量PCRにより各生殖巣キメラ由来精液におけるドナー寄与率の高低（相対値）を検討した。最もドナー寄与率が高い群は内部標準であるGAPDHと同等のシグナル強度を示しており、交配によりノックイン後代が得られると強く期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度予定した主なプロセスは、(1)ヒト抗体医薬ノックインベクターの構築、(2)ノックイン始原生殖細胞の構築、(3)G0キメラニワトリの樹立であり、いずれも本年度実現することが出来た。
（1）ヒト抗体医薬ノックインベクターの構築 従来の研究成果、研究資産を活用して上述のベクターを構築した。2つのサブユニットからなる複合体分子であることから、重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子の間を2A自己切断ペプチドの遺伝子で連結し、複合体分子の生産を目指すものとした。蛋白質生産において全抗体が産生されるかについてはノックイン鶏卵における発現蛋白質を検証する必要がある。
（2）ノックイン始原生殖細胞の構築 ノックイン配列特異的なプライマーセット（5’側ならびに3’側）を用いて始原生殖細胞にノックインベクターが挿入されたことを確認した。薬剤選択された細胞は順調に増殖し移植に十分な数を確保することが出来た。
（3）G0キメラニワトリの樹立 当初予定3-6羽を上回る雄キメラ個体を樹立、性成熟させた。精液解析では一部個体で内在性遺伝子と遜色のないレベルでノックインベクター遺伝子を検出しており、高いドナー寄与率が見込まれる。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度に樹立したG0キメラニワトリを野生型ニワトリと交配し、ノックインニワトリを後代に得る（G1ノックインニワトリ）。ノックインニワトリの検定は各個体より羽軸または血液を採取し、オボアルブミン遺伝子座へのノックインベクター挿入の有無をゲノムPCRにより行う。G1ノックイン雌（複数、2-3系統を予定）を性成熟させ、卵を採取し、抗体蛋白質の有無、性状、蛋白質量、抗原認識能や安定性等について解析を行う予定である。また、G2個体以降の鶏卵についても必要に応じて解析を行う。
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